伊豆赤沢海洋深層水から分離された微生物が 生産するアラビノキシラン分解酵素に関する研究 Studies on the arabinoxylanase produced by microorganisms from Izu-Akazawa deep-seawater 海洋生命科学専攻 応用微生物学研究室 1351004 安次嶺 一功

発表の流れ  第一章 背景説明  第二章 目的酵素生産候補株スクリーニング方法  第三章 16S rRNA遺伝子解析による菌種同定  第四章 標準菌株との生理・生化学的性状の比較  第五章 酵素活性増加の為の培養条件検討  第六章 分子量分画と酵素活性の至適条件検討  第七章 総括 2

200 m以深に分布する海水 ・低温性 ・富栄養性 ・清浄性 ・恒常性 表層水と異なる特徴を有する 3 (株)DHC DSW給水施設 洋上 5 km 水深 800 m 取水量 5,000 t/月 海洋深層水(DSW)とバッグフィルター(BF) DSWBF 出典:https://www.google.co.jp/maps/

アラビノキシラン(AX)と アラビノキシラン分解酵素(AXase) 4 AX: β1-4結合のD-キシロース主鎖にα1-3結合のL-アラビノース側鎖を持つ多糖 Arabinofuranosidase Xylanase Xylanase Arabinofuranosidase

L-アラビノースの機能 5 ○甘味度 スクロースの50％の甘味 ○代謝 人体への吸収はほとんど無い ○スクラーゼ阻害 スクラーゼを不拮抗的に阻害 糖吸収と血糖値上昇を抑制 ○カルシウム吸収促進 小腸でのカルシウム吸収を促進 工業的に生産されており、高コスト (D-グルコース ¥48/g L-アラビノース ¥297/g D-グルコースの約6倍の値段) 微生物種 分離源 発見年 Aspergillus niger 陸土壌 1963 Bacillus subtilis 陸土壌 1971 Aspergillus terreus 砂漠土壌 1996 Clostridium thermocellum 熱水泉 2011

DSWBF由来 分離微生物グリセロールストック 薄層クロマトによる一次スクリーニング 酵素活性測定による二次スクリーニング 6 候補株スクリーニングの流れ 分離時と同条件で増殖確認 AX粗分画液を唯一炭素源とする培地で増殖確認 1,019株 892株 502株 6株 2株 (No.92、No.138株)

No.92 Bacillus pumilus strain ATCC 7061 (98.4%) Bacillus safensis strain FO-036 (98.4%) Bacillus subtilis Bacillus licheniformis Bacillus indicus strain Sd/3T Bacillus simplex Bacillus megaterium strain: IAM 13418 Bacillus cohnii (DSM 6307 T) Bacillus halmapalus DSM 8723 Bacillus benzoevorans strain DSM5391 7 No.92株の 16S rRNA遺伝子解析による系統樹 リード数 1,219 bp. ()内は相同性

No.92株及び標準菌株との 生理・生化学的性状の比較 8 項目 No.92株 NBRC 100820T株 コロニー形状 不定形 円形 増殖可能NaCl濃度(%,w/v) 0-6 0-8 加水分解: ホスファターゼ +* － スキムミルク + － ツイーン80 + － 炭素源利用性: メチル α-D-グルコピラノシド － + D-ツラノース － + myo-イノシトール － + D-アラビノース + － *＋,陽性;－,陰性

No.138 Bacillus altitudinis strain 41KF2bT (99.3%) Bacillus pumilus Bacillus aerophilus strain 28KT Bacillus stratosphericus strain 41KF2aT Bacillus pumilus strain ATCC 7061 Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus aerius strain 24KT Bacillus sonorensis strain NRRL B-23154 Bacillus aquimaris strain GSP18 Bacillus marisflavi strain TF-11 9 No.138株の 16S rRNA遺伝子解析による系統樹 リード数 1,511 bp. ()内は相同性

No.138株及び標準菌株との 生理・生化学的性状比較 10 項目 No.138株 JCM 13350T株 増殖可能温度(℃) 5-50 5-30 加水分解: スターチ －* + ホスファターゼ + － スキムミルク + － ツイーン80 － + 炭素源利用性: マルトース + － メチル α-D-グルコピラノシド － + D-ズルシトール － + D-ソルビトール + － *＋,陽性;－,陰性

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0.00E+00 1.00E+05 2.00E+05 3.00E+05 4.00E+05 5.00E+05 6.00E+05 5 15 20 27 30 37 ■比活性 (U/mg) ■増殖量 (cells/ml) 温度 (℃) No.92株の酵素活性及び増殖量に与える 培養温度の影響 11

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0.00E+00 1.00E+05 2.00E+05 3.00E+05 4.00E+05 5.00E+05 6.00E+05 7.00E+05 5 15 20 27 30 37 ■比活性 (U/mg) ■増殖量 (cells/ml) 温度 (℃) No.138株の酵素活性及び増殖量に与える 培養温度の影響 12

酵素活性に与える最適培養条件 13 項目 No.92株 No.138株 温度 (℃) 20-27 20-27 pH 6.5-7.5 7.5 人工海水濃度 (%) 0 0 炭素源 無添加 無添加 窒素源 (NH4 )2 SO4 バクトペプトン

培養液中のAXaseの分子量分画 （50及び10 kDaフィルター） 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 10＞ 50＞, ≧10 ≧50 比活性 (U/mg) 分子量 (kDa) No.92株 No.138株 14 候補株のAXaseは50 kDa以上の画分に存在

0 20 40 60 80 100 120 10 20 30 40 50 60 相対酵素活性 (%) 温度 (℃) No.92株 No.138株 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 相対酵素活性 (%) pH No.92株 No.138株 50 kDa分子量粗分画AXaseの至適条件 15 ■No.92株 ■No.138株

総括  スクリーニングの結果、特に酵素活性の高い2株を候 補株とした。遺伝子の解析により、どちらもBacillus属 と同定した。  生理・生化学的性状を確認した結果、どちらの候補株 も標準菌株と様々な相違点が見られた。  分子量分画の結果、候補株のAXaseも50 kDa以上の 分子量であることが確認された。  粗画分したAXaseの至適条件を調べた結果、No.92 株は40℃、pH 8であり、No.138株は30℃、pH 8であ った。 16

謝辞 17 東京海洋大学 今田 千秋 教授 同 小林 武志 准教授 同 寺原 猛 博士 （株）DHC海洋深層水研究所 山田 勝久 博士 同 野村 道康 氏 同 鈴木 正宏 氏 有限会社イントロン 古門 幸三 氏 本学共同研究員 鈴木 誠治 氏 応用微生物学研究室 学生諸氏