Purification and properties of phenolic acid decarboxylase from Candida guilliermondii

採取した6H2N誘導細胞 生理食塩水溶液で二回洗浄し、緩衝液※１中に放置した。 ガラスビーズと共に細胞破砕装置で６回破砕(50s,2,500rpm)した。 12,000×g , 15min 上清 カラム;CM toyopearl 650M buffer; 20mM 2-モノホリノエタンスルホン酸(MES)緩衝液 活性フラクション カラム;DEAE toyopearl Fast Flow buffer;20mM MES緩衝液 洗浄液；50mM MES緩衝液（50mM NaClを含む） 溶出液；50mM MES緩衝液(50-400mM NaCl) ※リニアグラジエント溶出 濃縮液 カラム；Bio-Gel P-100 Buffer;50mM リン酸ナトリウム緩衝液 溶出液；50mM リン酸ナトリウム緩衝液 限外濾過 buffer;50Mリン酸緩衝液 限外濾過 精製酵素 （-２０℃で保存） ※これらの操作は４℃を越えない温度でおこなった

＜金属イオンの影響＞ ・Fe²⁺,Ni²⁺,Cu²⁺,Hg²⁺,は活性を完全に抑制した ・Zn²⁺は29％抑制した ・Ca²⁺,Mn²⁺,Co²⁺,Fe³⁺,Al³⁺の抑制効果は無いか、あってもわずかであった ・Mg²⁺の増加にともないFAとPCAに対する脱炭酸活性は増加した （最大活性は陽イオンを含まないコントロール活性の、それぞれ180％と153％に達した） ＜化学試薬の酵素活性影響＞

Fig2. Effects of pH and temperature on the activity of purified CgPAD 測定に用いた緩衝液(○;酢酸ナトリウム,▲;MES,△;リン酸ナトリウム, ●;Britton-Robinson汎用緩衝液) 様々な緩衝液を用いて測定した結果、pH 6.1のときに最大の活性が見られた。 Britton-Robinson汎用緩衝液を用いた結果、5.9が最適pHであった。 4.3以下及び、8.8以上のpHのときは活性が見られなかった。

Fig2. Effects of pH and temperature on the activity of purified CgPAD 測定条件(○;MgCl₂存在下, ● ;MgCl₂非存在下) FAを基質として用いた際、約25℃で最大の活性が見られ、Mg²⁺イオン存在下で はでは25-30℃で最大の活性が見られた。 試験した温度領域内では活性が２価の陽イオンに刺激されていた。 陽イオン非存在下で、0℃の際も最大の50％以上の活性が測定された。

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a. FAを加えた時のHPLCの溶出プロフィル FAと4-VGの保持時間はそれぞれ2.83minと3.90min b．PCAを加えた時のHPLCの溶出プロフィル PCAと4-VPの保持時間はそれぞれ2.79minと3.75min

まとめ • この研究で、イオン交換クロマトグラフィーによりC. guilliermondii ATCC 9058由来のPAD(CgPAD)が精製した。 • この酵素は同一サブユニットを持つホモ二量体で他の酵母や細菌の持 つ酵素と類似していた。 • CgPADは低温に適合し、０℃の際でも至適温度の場合の50%以上の活性 を表した。 • CgPADは他の微生物由来PADsのように熱には不安定であった。 • 重金属イオン及び4-chloromericuribenzoateはCgPADの活性を完全に阻 害した。 • 6H2Nによる過誘導はグラム陰性菌において報告されており、生物が 6H2Nを分解しなければPADsを誘導するように見え、実際HPLCによる測定 で6H2NはC. guilliermondii ATCC 9058によって分解されていなかった。 • C. guilliermondii ATCC 9058が好気的培養している際、FAから4-VGへ,PCA から4-VPへの変換が24時間以内に完了していた。 • 結果、CgPADを用いた反応はフレーバーや香りの前駆体となる4-VG及び 4-VPの工業的生産に応用できると考えられる。