ミクロシスチン_発表0131

Transcript

1. アオコ発生水田からの ミクロシスチン-LR分解菌の単離 西田恵美 馬形さやか
2. 目次 ・研究背景 ・研究意義/目的 ・実験概要 ・実験方法/結果 -耐性試験- ・実験方法/結果 -分解性試験- ・菌株同定結果 ・まとめ 2
3. 目次 ・研究背景 ・研究意義/目的 ・実験概要 ・実験方法/結果 -耐性試験- ・実験方法/結果 -分解性試験- ・菌株同定結果 ・まとめ 3
4. ・藍藻類が産生する細胞内毒素 ・魚類・植物・哺乳類に毒性 ・ミクロシスチン-LR(MC-LR)が特に強い毒性 研究背景 ミクロシスチン Ex) 1996年2月ブラジル カルアル市 100人：急性肝機能不全，50人：死亡 （彼谷邦光（2001）『飲料水に忍び寄る有毒シアノバクテリア』p11より） 4
5. 図1.ミクロシスチンの構造 ◦問題点 ・有害な副生成物が発生 Ex)ホルムアルデヒド ・高度処理のコストが高い ・処理能が低い ◦ミクロシスチン処理方法 浄水： 塩素処理＋高度処理 ・オゾン処理 ・紫外線処理 ・活性炭処理 等 研究背景 5
6. 目次 ・研究背景 ・研究意義/目的 ・実験概要 ・実験方法/結果 -耐性試験- ・実験方法/結果 -分解性試験- ・菌株同定結果 ・まとめ 6
7. 研究意義 バイオレメディエーション 生物やその酵素を用いた環境浄化方法 ・安価 ・広範囲に適用可能 ・化学試料の使用が少ない ミクロシスチン分解菌がいる湖沼 ↓ 2-10日間ほどで90%程度のミクロシスチンが分解 7
8. 目的 ミクロシスチン-LRの分解能力を有する微生物を 環境中から単離し,その分解能を調査 ・分解菌の同定 ・分解の速さ 明らかに 8
9. 目次 ・研究背景 ・研究意義/目的 ・実験概要 ・実験方法/結果 -耐性試験- ・実験方法/結果 -分解性試験- ・菌株同定結果 ・まとめ 9
10. 実験概要 ・試料採取対象環境 : アオコ発生水田 水試料から単離した細菌 分解性試験 分解菌 ： なし 土壌試料から単離した細菌 耐性試験 耐性菌 ：2株得られた 分解菌 ： 3株得られた 分解性試験 図2.アオコ発生時の水田の様子 得られた3株を同定 10
11. 目次 ・研究背景 ・研究意義/目的 ・実験概要 ・実験方法/結果 -耐性試験- ・実験方法/結果 -分解性試験- ・菌株同定結果 ・まとめ 11
12. 土壌試料より単離した細菌のMC-LR耐性試験 試料採取 基礎培養 耐性試験 ・24時間 ・30℃ ・時期：稲収穫後（11月） ・場所：田圃 使用培地 ・MSM+MC-LR Agar ・0.85% NaCl+MC-LR Agar ・DM+MC-LR Agar ・DM(w/o N,C)+MC-LR Agar 条件 ・7日間 ・30℃ R2A平板寒天培地 12
13. ミクロシスチン-LR耐性試験 使用寒天培地 栄養塩類を含み窒素源・炭素源を含まずMC-LRのみを主栄養源とする 培地 細菌に等張な生理食塩水と主栄養源となるMC-LRのみの培地 DM(w/o N,C)+MC-LR Agar 窒素源と炭素源を含むため富栄養条件下のMC-LR耐性の有無を試験 できる培地 窒素源と炭素源を除いた条件下のMC-LR耐性の有無を試験できる培地 MSM+MC-LR Agar 0.85% NaCl+MC-LR Agar DM+MC-LR Agar 13
14. 結果 菌を播いた培地の種類 株番号 MSM +MC-LR Agar DM +MC-LR Agar 0.85% NaCl +MC-LR Agar DM (w/o N,C) +MC-LR Agar s1 - ◦ - - s2 - ◦ - - s3 - ◦ - - s4 - ◦ - - s5 - ◦ - - s6 - ◦ - - s7 - ◦ - - s8 - ◦ - - s9 - ◦ - - s10 - ◦ - - s11 ◦ ◦ ◦ ◦ s12 ◦ ◦ ◦ ◦ ※◦：コロニー形成あり、-：コロニー形成なし 14 表1. 土壌試料から単離した細菌のミクロシスチン耐性試験結果
15. 結果 図3.MSM+MC-LR Agar 培養結果 栄養塩類を含み窒素源・炭素源を含まず MC-LRのみを主栄養源とする培地 MSM+MC-LR Agar 15
16. 結果 図4. 0.85%NaCl+MC-LR Agar 培養結果 細菌に等張な生理食塩水と主栄養源となる MC-LRのみの培地 0.85% NaCl+MC-LR Agar 16
17. 結果 菌を播いた培地の種類 株番号 MSM +MC-LR Agar DM +MC-LR Agar 0.85% NaCl +MC-LR Agar DM (w/o N,C) +MC-LR Agar s1 - ◦ - - s2 - ◦ - - s3 - ◦ - - s4 - ◦ - - s5 - ◦ - - s6 - ◦ - - s7 - ◦ - - s8 - ◦ - - s9 - ◦ - - s10 - ◦ - - s11 ◦ ◦ ◦ ◦ s12 ◦ ◦ ◦ ◦ ※◦：コロニー形成あり、-：コロニー形成なし #11,12株について、 MC-LRのみを栄養とする環境下で生育を確認 ↓ #11,12株はMC-LRに対して耐性をもつ 17
18. 目次 ・研究背景 ・研究意義/目的 ・実験概要 ・実験方法/結果 -耐性試験- ・実験方法/結果 -分解性試験- ・菌株同定結果 ・まとめ 18
19. 分解菌探索の流れ 7日後残存量がコントロールの50%以下 分解性有り 培養 分解性試験 分析 ・菌株同定 ・分解の速さ 明らかに
20. 前培養 本培養 ・7日間 ・30℃ 基礎培養 ・24時間 ・30℃ 試料採取 ・時期：稲収穫後（11月） ・場所：田圃 R2A平板寒天培地 乾燥ブイヨン培地 土壌試料より単離した細菌のMC-LR分解性試験 培養 乾燥ブイヨン培地 ・24時間 ・30℃ 20
21. 集菌・洗浄 分解性試験 ・7日間 ・20℃ ・MC-LR: 1μL/mL ・3000rpm ・10分間 ・5℃ 無機塩培地 無機塩培地 アオコ発生水田から採取した土壌試料より単離した 細菌の液体培地によるMC-LR分解性試験 分解性試験 21
22. 固相抽出 3M エムポアディスク SDB-XD(47mm) 分解性試験液 ・50mL 溶出 ・0.1%TFA含有メタノール7mL 吸引濾過 分析 アオコ発生水田から採取した土壌試料より単離した 細菌の液体培地によるMC-LR分解性試験 窒素濃縮 22
23. LC/PDA アオコ発生水田から採取した土壌試料より単離した 細菌の液体培地によるMC-LR分解性試験 条件 ・カラム：Wakosil-Ⅱ 5C18 HG 4.6φ×150mm ・移動相A ：50mMりん酸二水素カリウム水溶液45% ・移動相B ：メタノール55% ・注入量：100μl ・カラム温度：40℃ ・流速：1.0ml/min ・検出： UV238nm 分析 23
24. 0.889 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 C s1 s2 s3 s4 s5 s6 s7 s8 s9 s10 s11 s12 mg/L 菌株番号 1回目 分解性試験後の MC-LR添加MSM中MC-LR7日目残存量 MSM中MC-LR残存量 結果 C: コントロール 図5. 1回目 分解性試験後のMC-LR添加MSM中MC-LR7日目時点残存量 24
25. 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 C 0 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 MSM中MC-LR残存量 日数 ※C：コントロール 結果 図6. 4株2回目 分解性試験後の MC-LR添加MSM中MC-LR経日残存量 0.889 4株2回目 分解性試験後の MC-LR添加MSM中MC-LR経日残存量 25
26. 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 C 0 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 MSM中MC-LR残存量 日数 結果 図6. 11株2回目 分解性試験後の MC-LR添加MSM中MC-LR経日残存量 0.889 C: コントロール 11株2回目 分解性試験後の MC-LR添加MSM中MC-LR経日残存量 26
27. 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 C 0 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 MSM中MC-LR残存量 日数 結果 C: コントロール 図6. 12株2回目 分解性試験後の MC-LR添加MSM中MC-LR経日残存量 0.889 12株2回目 分解性試験後の MC-LR添加MSM中MC-LR経日残存量 27
28. 目次 ・研究背景 ・研究意義/目的 ・実験概要 ・実験方法/結果 -耐性試験- ・実験方法/結果 -分解性試験- ・菌株同定結果 ・まとめ 28
29. 菌株同定結果 ・s4株：Bacillus aryabhattai 耐寒性および紫外線抵抗性が高い ⇒紫外線曝露量の多い地域における利用に適する ・s11株：Paenibacillus sp. PCBのバイオレメディエーション、キチン分解に使われている種がある ⇒MC-LRにも利用できることが判明 ・s12株：Bacillus cereus / Bacillus anthracis 人や動物に重篤な疾病を引き起こす ⇒バイオレメディエーションに不適 16SrDNA-500 Rapid解析 (株)テクノスルガ・ラボ 29
30. 目次 ・研究背景 ・研究意義/目的 ・実験概要 ・実験方法/結果 -耐性試験- ・実験方法/結果 -分解性試験- ・菌株同定結果 ・まとめ 30
31. 水試料から単離した細菌 分解菌 ： なし 土壌試料から単離した細菌 分解菌 ： 3株得られた 得られた3株を同定 まとめ ・4株：Bacillus aryabhattai ⇒紫外線曝露量の多い地域における利用に適する ・11株：Paenibacillus sp. ⇒MC-LRにも利用できることが判明 ・12株：Bacillus cereus / Bacillus anthracis ⇒バイオレメディエーションに不適 31
32. -END- 32