Anomalies de terrain remontées à l'ONAB

Cécile Grohs (INRAe) Stéphanie Minéry (idele)

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1. Anomalies remontées du terrain à l’ONAB 1. Stéphanie Minéry Observations terrain 2. Déclaration à l’ONAB (fiche, photo et prélèvement) 3. Analyse des cas à l’ONAB et Priorisation 4.1 La cause est identifiée 4.2 La cause n’est pas identifiée 5. Gestion de l’anomalie génétique  Continuer à déclarer les cas Cécile Grohs
2. Nous avons étudié avec succès une quarantaine d’anomalies Anomalies par grandes fonctions anatomiques • Malformations /déformations anatomiques / organes manquants • Anomalies musculo-squelettiques • Atteintes du système nerveux / comportement • Anomalies de la peau et des phanères (cornes, poils, robe) • Défaillances du système immunitaire ou métabolique
3. 1. Anomalie musculosquelettique : le bulldog en race Holstein • Phénotype sévère : anomalie létale principalement caractérisée par une réduction de la croissance des os longs • Années 2000, dans la descendance d’un seul taureau élite Holstein français (IGALE BD) à <1%  déterminisme récessif ? • Cartographie génétique : Chr5, grand intervalle avec gène candidat COL2A1 • Séquence du gène sans résultat • Absence de veau bulldog parmi une 30 aine de veaux issus d’IGALE et de mères ayant déjà eu un premier veau bulldog  déterminisme dominant, avec mosaïcisme ? (Agerholm et al., 2004)
4. 1. Le bulldog, 12 ans plus tard • En 2012 : arrivée des techniques de séquençage automatique de génomes complets • Outil de choix pour identifier une mutation dominante : la mutation est forcément absente du génome d’animaux sains (≠ récessif) • L’idée est de séquencer un ou deux atteints et de filtrer contre tout ce qui est présent dans d’autres génomes Nombre de polymorphismes détectés Polymorphismes hétérozygotes absent chez les 526 animaux et prédits comme délétères Mutation candidate Bulldog N°1 5,690,540 17 Bulldog N°2 6,350,410 23 En commun COL2A1 p.G960R 3,826,591 1
5. 1. Le bulldog : validation du variant et du mosaïcisme • Le gène COL2A1 code pour une des chaînes du collagène de type II essentielle à la croissance en longueur des os • Chez l’homme, même pathologie • La mutation entraîne une modification des acides aminés de la protéine, empêchant sa formation correcte • Validation chez les descendants d’Igale par génotypage PCR-RFLP G (allèle normal) A (mutation) 341 bp 175 bp 166 bp Veau BD Mère Veau BD Igale
6. 2. Anomalie de la peau : l’épidermidolyse bulleuse  • Phénotype sévère : décollement majeur de l’épiderme, entrainant l’euthanasie à la naissance • Connu dans de nombreuses espèces dont l’homme, avec des degrés variables • Deux études successives conduites dans la même race 1- Quatre déclarations issues d’accouplements consanguins en rache charolaise (1 seul échantillon) 2- Trois déclarations issues d’accouplements consanguins avec un phénotype moins sévère, mais qui ne portent pas la mutation identifiée dans la première étude • Déterminisme supposé récessif © R. Braque © A. Capitan 
7. Etude 1 • Phénotypage fin par analyse histologique : Coupes transversales de peau (atteint) : Décollement entre le derme et l’épiderme Situé sous les kératinocytes (coloration H&E) • Etude du pedigree et confirmation du déterminisme récessif supposé (coloration H&E) Ancêtre commun né en 1986 7
8. Etude 1 • Cartographie génétique : recherche de la région homozygote du génome en association avec le phénotype IMPOSSIBLE • Autre approche : à partir de la séquence complète de génome, par bio-info 1. Recherche de régions d’homozygotie chez l’animal 54 régions identifiées d’une taille supérieure à 1 Mégabase 2. Dans les 54 régions : Recherche de gènes ou de variants candidats, absent des génomes contrôles (8 charolais sains et 234 animaux de toutes races)  Pas de petites variations homozygotes prédites comme délétères (SNP ou INDEL)  Un gène candidat : ITGB4 (sur le chr.19) connu pour causer de l’épidermolyse bulleuse jonctionnelle  Identification d’une grande délétion des exons 17 à 23 8
9. Etude 1 https://www.eurogct.org/fr/epi dermolysisbullosa Jonction dermo-épidermique 9 • Complexe de protéines qui assure l’ancrage de l’épiderme au derme
10. Etude 1 • La délétion ampute la protéine ITGB4 de toute la partie transmembranaire et cytoplasmique L’ancrage n’est plus fonctionnel • L’identification de la mutation a permis la mise en place d’un test sur mutation : IMPORTANT pour les anomalies récessives 10 Complexe de protéines qui assure l’ancrage de l’épiderme au derme
11. Etude 2 SNP dans un site d’épissage Histopathologie Détachement dermeépiderme + inflammation 11 Pedigree des veaux atteints  Déterminisme récessif Séquençage du génome complet de deux cas Cartographie Chromosome 2 Gène ITGA6, partenaire d’ITGB4 1 variant : SNP homozygote Délétère absent de plus de 5000 génomes contrôles Le SNP est dans un site d’épissage
12. Etude 2 Validation du variant candidat Etude moléculaire des conséquences du variant Biopsie d’oreille d’un animal porteur, conservé à - 80°C Amplification des ARN Sain Port T+  Rétention de deux introns Décalage du cadre de lecture Protéine anormale raccourcie : - 40% T- • Mise en place d’un test sur mutation 650 500 400 E14 E15 E14 E15 E16 E16 1. ARN épissé • Fréquence dans la population estimée à : c.2160 +1T c.2160 +1G E14 E14 E15 E15 E16 E16 c.2160 +1T 2. ARN non-épissé • 0,4% en MN, • absente en IA
13. En conclusion : • Exemples d’anomalies musculosquelettique et de la peau • En races laitières et allaitantes • Déterminismes variés selon les cas : dominant, récessif… • Nous avons élucidé le mystère des bulldog plus de 10 ans après, grâce aux progrès technologiques actuels • Nous avons identifié 2 mutations distinctes, dans les 2 gènes codant pour les 2 membres d’une protéine dimérique, provoquant une épidermolyse bulleuse en race charolaise • L’ONAB reçoit toutes les déclarations du terrain ! • Nous avons étudié avec succès une quarantaine d’anomalies • Alors ayez le bon réflexe : déclarez, photographiez, envoyez ! 13
14. www.onab.fr Merci pour votre attention Merci pour votre attention