defense2016

Transcript

1. Note that the podium blocks the view!
2. Annotation-agnostic differential expression and binding analyses Leonardo Collado-Torres @fellgernon
3. Mo6va6ng problem: iden6fy and validate regions of the genome that change expression during brain development
4. Research theme - annota6on-agnos6c - reproducible analyses - easily accessible data - sta6s6cal tools for the genomics community
5. RNA-seq reads Genome (DNA) RNA transcripts (many possible variants) Measuring gene expression: RNA-seq Adapted from @jtleek
6. Genome (DNA) Mapped reads Adapted from @jtleek Common analysis pipelines: • Feature coun6ng (gene or exon level) • Transcript assembly
7. Challenges in counting hFp://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html
8. Annotation variation Frazee et al, Biostatistics, 2014
9. DER finder approach •  Find con6guous base pairs with Differen6al Expression signal à DE Regions or DERs •  Find nearest annotated feature
10. coverage vector 2 6 0 11 6 Genome (DNA) Read coverage Adapted from @jtleek
13. Collado-Torres et al, bioRxiv, 2016 GTEx data 0 4 8 16 32 64 Liver Heart Testis Coverage STK19, 0 bp from tss: covers − + Genes 31978500 31979500 31980500 31981500 + Tx chr6
14. 0 1 2 Neo.F Neo.A notNeo.F notNeo.A CBC.F CBC.A Mean coverage IL17RD, 72831 bp from tss: overlaps 3' − + Genes 57124000 57126000 57128000 57130000 − Tx chr3 Coverage dip Detect artifacts
15. Input data n samples → ~348 million nt 11.24% coverage Rows with at least 1 sample with coverage > 5 Adapted from @jtleek
16. •  Null model •  Alterna6ve Model Finding DERs by expressed regions • Find regions of the genome with expression data • Compute coverage matrix • Apply sta6s6cal tests i: expressed region j: sample
18. Project size is increasing • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 2009 (11) 2010 (46) 2011 (121) 2012 (235) 2013 (408) 2014 (625) 2015 (548) 2016 (18) 7 8 9 10 11 12 Project size in base−pairs over the years log10 base−pairs per project hFps://jhubiosta6s6cs.shinyapps.io/recount/
19. • Data: 3 6ssues (liver, tes6s, heart), 8 samples each • Align with • Iden6fy expressed regions with derfinder – Adjust coverage (40 million) – Find expressed regions (cutoff 5) – Discard ERs < 9 bp GTEx: DERs via expressed regions
20. Presence of intronic ERs Can strictly intronic ERs differen6ate 6ssues?
21. PCs differentiate tissues
22. Differential intronic ERs | exonic ERs
23. Differential intronic ERs | exonic ERs 0 8 32 64 128 Liver Heart Testis Coverage RBX1, 395 bp from tss: inside − + Genes 40951000 40951500 40952000 40952500 + Tx chr22
24. Simulation setup 3 replicates: 2 groups, each with 5 samples ~2 million paired-end reads for chr17 1/6 high, 1/6 low in group 2 vs group 1 Annota6on: complete missing 20% of transcripts (8.28% exons) Reference set: 3868 exons that overlap only 1 transcript
25. Simulation results •  Similar power to methods that have complete annota6on •  Methods with incorrect annota6on lose a lot of power •  Higher empirical FDR/FPR
26. Identifying brain development DERs Fetal Infant Child Teen Adult 50+ 6 / group, N = 36 Discovery data Null: Alt: Models Initial results Jaffe et al, Nat. Neuroscience, 2015 50,650 DERs replicated 63,135 DERs Final results
27. Age-associated DERs lack regional specificity in the human brain BrainSpan data Jaffe et al, Nat. Neuroscience, 2015
28. Propor6on of Cells Expression changes across development may represent a changing neuronal phenotype Jaffe et al, Nat. Neuroscience, 2015 Estimation method: Houseman et al, BMC Bioinformatics, 2012
29. Collado-Torres et al, F1000Research, 2015 regionReport chr start end strand p-value chr1 1000 2000 + 0.9 chr2 5000 8000 - 0.001 chr3 2468 2668 + 0.051 . . . . . . . . . . . . . . . chrX 6000 6300 + 0.009 chrX 6500 6800 - 0.5 Genomic workflow: identify regions renderReport (A) default (B) custom (C) derfinderReport (D) DESeq2Report (E) edgeReport Create HTML/PDF report
30. Collado-Torres et al, F1000Research, 2015 regionReport
31. Collado-Torres et al, F1000Research, 2015 Interactive HTML reports (A) (B) Clickable buttons: show/hide code
32. Collado-Torres et al, F1000Research, 2015 Interactive HTML reports (A) (B)
33. Chromatin immunoprecipitation seq. http://assets.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/images/techniques/large/web-graphic-chipseq-workflow-large.jpg
34. Common ChIP-seq analysis pipeline Sample 1 Sample 2 ... Sample N 1 call peaks call peaks call peaks U 11 U 12 U 1N Number of unique peaks Merge unique peaks Total peaks: U merged ≤ U 1 + U 2 Determine differentially bound peaks between groups 1 & 2 Total tests: U merged 1 Total: U 1 Sample 1 Sample 2 ... Sample N 2 call peaks call peaks call peaks U 21 U 22 U 2N Number of unique peaks 2 Total: U 2 Group 1 Group 2 (A) (A) (B) (C)
35. Common ChIP-seq analysis pipeline 10400 10600 10800 11000 11200 11400 0 8 16 32 64 128 256 (−1,0] (0,1] (1,10] (10,20] (20,30] (30,100] Coverage MROH1 , 84229 bp from tss: inside − + Genes 145287800 145288000 145288200 145288400 145288600 145288800 − + Tx chr8 0 8 16 32 64 128 256 (−1,0] (0,1] (1,10] (10,20] (20,30] (30,100] Coverage MROH1 , 84229 bp from tss: inside − + Genes 145287800 145288000 145288200 145288400 145288600 145288800 − + Tx chr8 Merged peak Non-overlapping peaks (A) (B) Shuhla et al, PLoS Gene6cs 2013
36. derfinder applied to ChIP-seq data • Find regions of the genome with binding data • Smooth binding signal • Compute coverage matrix • Apply sta6s6cal tests
38. Brain ChIP-seq data EpiMap project
39. Regions with binding signal DBRs overlap with Ensembl v75 features exon intergenic intron 0 6170 5963 0 711 8269 923 8720 DBRs overlap with Ensembl v75 features exon intergenic intron 0 155897 57577 0 8426 36591 2833 7125 H3K4me3 H3K27ac
40. Variation mostly explained • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 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41. Differentially bound regions 0 16 64 128 256 512 A:N−:− A:N+:− A:N−:+ A:N+:+ D:N−:− D:N+:− D:N−:+ D:N+:+ Coverage PRB2, 0 bp from tss: overlaps 5' − + Genes 11652500 11653000 11653500 11654000 11654500 − Tx chr12
42. Differentially bound regions H3K4me3 DBRs by main covariates Brain region Cell type Age at death 0 1 14604 209 0 0 48 0 H3K27ac DBRs by main covariates Brain region Cell type Age at death 0 2 178869 1235 0 0 156 0 H3K4me3 H3K27ac
43. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 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type or age at death
44. •  Resource with data from 2,040 projects •  Aligned with •  Total RNA-seq samples: 49,657 + 9,662 = 59,319 hFps://jhubiosta6s6cs.shinyapps.io/recount/
45. recount: via the web hFps://jhubiosta6s6cs.shinyapps.io/recount/
47. Mo6va6ng problem: iden6fy and validate regions of the genome that change expression during brain development 1. derfinder permits discovery of novel expressed & differen6ally bound regions 2.  we iden6fied & validated gene expression changes in the developing brain 3.  we have developed tools for reproducible shareable repor6ng 4.  these tools can be easily be used to process 2,040 projects via recount
48. References + software + code •  Collado-Torres, et al. bioRxiv (2016) doi:10.1101/015370 –  http://bioconductor.org/packages/derfinder –  http://leekgroup.github.io/derSupplement/ •  Collado-Torres, et al. F1000Research (2015) doi:10.12688/f1000research.6379.1 -  http://www.bioconductor.org/packages/regionReport -  http://leekgroup.github.io/regionReportSupp/ •  Collado-Torres and Nellore, et al. in prep –  https://github.com/leekgroup/recount –  https://jhubiostatistics.shinyapps.io/recount •  Nellore, Collado-Torres, et al. bioRxiv (2015) doi:10.1101/019067 -  rail.bio • Nellore, …, Collado-Torres, et al. bioRxiv (2016) doi:10.1101/038224 - intropolis.rail.bio •  Jaffe, Shin, Collado-Torres, et al. Nat. Neurosci. (2015) doi:10.1038/nn.3898 –  https://github.com/lcolladotor/libd_n36 –  https://github.com/leekgroup/enrichedRanges
49. Acknowledgements Committee members Jeffrey Leek Daniele Fallin Kasper Hansen Alexis Battle Andrew Jaffe Hongkai Ji Fernando Pineda Collaborators Alyssa Frazee Abhinav Nellore Michael Love Ben Langmead Rafael Irizarry Funding NIH LIBD JHU-Biostats CONACyT México
54. Single-base F-statistics •  Null model •  Alterna6ve Model •  F-sta6s6c i: base-pair j: sample Collado-Torres et al, bioRxiv, 2015
55. Single-base F-statistics Collado-Torres et al, bioRxiv, 2015 BrainSpan data
56. Compare DERs vs annotation Collado-Torres et al, bioRxiv, 2015 BrainSpan data
57. Jaffe et al, Nat. Neuroscience, 2015
58. Widespread differential expression of novel transcriptional activity Jaffe et al, Nat. Neuroscience, 2015
59. DERs validate: Cytosolic vs total mRNA fractions Jaffe et al, Nat. Neuroscience, 2015
60. Age-associated DERs are conserved in the developing mouse cortex Mouse cerebral cortex, comparing E17 (N=4) to adult (N=3) C57BL/6 mice Data from Dillman 2013 Jaffe et al, Nat. Neuroscience, 2015
61. CBC: 28 MD: 24 STR: 28 AMY: 31 HIP: 32 DFC: 34 Total N samples: 487 BrainSpan data Coverage Data from BrainSpan: hFp://download.allenins6tute.org/brainspan/MRF_BigWig_Gencode_v10/ VFC: 30 MFC: 32 OFC: 30 M1C: 25 S1C: 26 IPC: 33 A1C: 30 STC: 35 ITC: 33 V1C: 33