Tesis doctoral

Aquí el resultado de varios años de investigación en Immunología, en concreto en el papel de ciertos derivados de la Mitramicina A como antitumorales.

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1. Programa de doctorado de Biología Funcional y Molecular Departamento de Biología Funcional Universidad de Oviedo Estudio de la acción antitumoral de diversos derivados de la Mitramicina A Azahara Fernández Guizán Oviedo, 2013
2. CÁNCER Modificado de Hanahan y Weinberg, 2011. INTRODUCCIÓN Autosuficiencia señales proliferativas Insensibilidad señales antiproliferativas
3. INTRODUCCIÓN CONTROL DEL CICLO CELULAR Punto de control fase G1 a fase S G2 G1 S Fase M G1 atm p53 p21 CDK4/6-Ciclina D CDK2- Ciclina E e2f rb c-myc S mdm2 p14 p16 p27 p57
4. CÁNCER INTRODUCCIÓN Modificado de Hanahan y Weinberg, 2011. Autosuficiencia señales proliferativas Insensibilidad señales antiproliferativas Evasión muerte celular programada
5. INTRODUCCIÓN EVASIÓN DE LA APOPTOSIS Modificado de David Givol, Weinzmann Institute of Science. Caspasa 9 Apoptosis Caspasa 3 Caspasa 8 Citocromo C Apaf-1 Estímulos apoptóticos FAS-R TNF-α FAS-L SMAC p53 IAPs BAX PUMA BCL-2 p53
6. CÁNCER Modificado de Hanahan y Weinberg, 2011. INTRODUCCIÓN Autosuficiencia señales proliferativas Insensibilidad señales antiproliferativas Evasión muerte celular programada Ilimitado potencial de replicación Angiogénesis
7. INTRODUCCIÓN ANGIOGÉNESIS
8. CÁNCER INTRODUCCIÓN Modificado de Hanahan y Weinberg, 2011. Autosuficiencia señales proliferativas Insensibilidad señales antiproliferativas Evasión muerte celular programada Ilimitado potencial de replicación Angiogénesis Invasión tisular y metástasis Modificaciones metabólicas Microambiente tumoral
9. INTRODUCCIÓN CÁNCER DE OVARIO Gráfico obtenido de la SEOM proteinatlas.org Células tumorales Estroma
10. OBJETIVOS Modificado de Hanahan y Weinberg, 2011. Proliferación celular Evasión apoptosis Angiogénesis TRATAMIENTO DEL CÁNCER
11. INTRODUCCIÓN TRATAMIENTO DEL CÁNCER Grupos de quimioterápicos en función de su mecanismo de acción Principales quimioterápicos Agentes alquilantes Mostazas nitrogenadas, nitrosureas, sulfonatos alquilados, triacinas, etilenaminas Antimetabolitos Metotrexano, raltitrexel, fluoracilo, ftorafur, citacarabina, fludarabina Derivados del platino Cisplatino, oxaliplatino, carboplatino Inhibidores topoisomerasas Etopósido, tenopósido, posorrubicina, irinotecan, topotecan Inhibidores mitóticos Taxanos, epotilones, vinca-alcaloides, estramustina Antibióticos antitumorales Antraciclinas, actinomicina D, bleomicina, mitomicina Otros Pentostatina, bleomicina, L-asparaginasa
12. Tipo de fármaco según mecanismo de acción Principales anti-angiogénicos Inhibidores factores pro-angiogénicos Bevacizumab, Aflibercept, MV303, FLT2-11 Inhibidores endógenos TSP-1, Angiostatina, Endostatina Inhibidores de la transducción de señal Sunitinib, Sorafenib, Lavendustin A, Costunolide Inhibidores de la ciclooxigenasa Indometacina, SC236, Humulone Inhibidores de las metaloproteasas TIMP-2, TIMP-3, Marimastat, Batimastat Bloqueadores de las interferinas Vintaxin, Tumstatina, Thiolutina Otros VDA, Talidomida, Inhibidores de la ECA INTRODUCCIÓN TRATAMIENTO DEL CÁNCER
13. INTRODUCCIÓN MITRAMICINA
14. Sp1a ❑ Ciclo celular (ciclinas) (Sherr y Roberts, 1999 Abdelrahim y cols., 2002; Lagger y cols., 2003; Feng y cols., 2000), ❑ Invasión y metástasis (Yuan y cols., 2007a), ❑ Estabilidad genómica (Kavurma y cols., 2001; Kavurma y Khachigian, 2003), ❑ Angiogénesis (Vegf) (Pore y cols., 2004) INTRODUCCIÓN Sp1 ▪Niveles elevados de Sp1 en tumores epiteliales (Kumar AP. y cols., 1999) ▪En cancér de páncreas papel clave en la agresividad y metástasis (Yuang P. y cols., 2007)
15. Sp1a Sp1b L1Sp3 L2Sp3 M1Sp3 M2Sp3 INTRODUCCIÓN Sp1
16. OBJETIVOS 1. Dilucidar los mecanismos de acción responsables de la diferente actividad antitumoral y toxicidad de los derivados de la MTA, en particular del DIG-MSK. 2. Estudiar el efecto que producen estos compuestos sobre la supervivencia y la muerte celular, y sobre la regulación del ciclo celular en líneas tumorales de ovario. 3. Evaluar la capacidad antiangiogénica de estas mitramicinas.
17. OBJETIVO 1 1. Dilucidar los mecanismos de acción responsables de su diferente actividad antitumoral y toxicidad de los derivados de la MTA, en particular del DIG-MSK. 2. Estudiar el efecto que producen estos compuestos sobre la supervivencia y la muerte celular, y sobre la regulación del ciclo celular en líneas tumorales de ovario. 3. Evaluar la capacidad antiangiogénica de estas mitramicinas.
18. METODOLOGÍA Transcripción mediada por Sp3 Captación Unión al ADN Transcripción mediada por Sp1 Protooncogenes ❑ Líneas utilizadas: A2780 OVCAR-3 IGROV-1 ❑ Compuestos utilizados: MTA MSK EC-7073 DIG-MSK EC-8044
19. RESULTADOS Las modificaciones estructurales de los derivados de la MTA no conllevan una modificación en su patrón de captación CÉLULA ENTERA NÚCLEO A2780 OVCAR-3 IGROV-1 CÉLULA NÚCLEOS CÉLULAS CAPTACIÓN (%) MTA MTA DIG-MSK FLUORESCENCIA MTA MSK 7073 DIG-MSK 8044 MTA MSK 7073 DIG-MSK 8044 MTA MSK 7073 DIG-MSK 8044 MTA MSK 7073 DIG-MSK 8044 MTA MSK 7073 DIG-MSK 8044 MTA MSK 7073 DIG-MSK 8044
20. RESULTADOS Los cambios estructurales que presentan MSK y DIG-MSK alteran su especificidad de unión al ADN con respecto a la MTA
21. RESULTADOS DIG-MSK es un potente inhibidor de la transcripción mediada por Sp1 GC GC GC GC Sp-1 Sp-1 LUC
22. RESULTADOS DIG-MSK es un potente inhibidor de la transcripción mediada por Sp1 GC GC GC GC Sp-1 Sp-1 TSA LUC
23. RESULTADOS DIG-MSK es un potente inhibidor de la expresión de Sp1
24. RESULTADOS MTA y DIG-MSK regulan la expresión de diversos protooncogenes Niveles ARNm relativos a GADPH DMSO MTA DIG-MSK
25. RESULTADOS DIG-MSK es un inhibidor más potente que la MTA de la transcripción mediada por Sp3 GC GC GC GC Sp-3 Sp-3 LUC
26. RESULTADOS DIG-MSK es un inhibidor más potente que la MTA de la expresión de Sp3 ** **
27. DISCUSIÓN Captación eficaz Diferente unión al ADN Inhibición de la transcripción mediada por Sp1 Regulación de la expresión de protooncogenes Inhibición de la transcripción mediada por Sp3 DIG-MSK
28. OBJETIVO 2 1. Dilucidar los mecanismos de acción responsables de su diferente actividad antitumoral y toxicidad de los derivados de la MTA, en particular del DIG-MSK. 2. Estudiar el efecto que producen estos compuestos sobre la supervivencia y la muerte celular, y sobre la regulación del ciclo celular en líneas tumorales de ovario. 3. Evaluar la capacidad antiangiogénica de estas mitramicinas.
29. METODOLOGÍA Modificado de Hanahan y Weinberg, 2011. Proliferación celular Evasión muerte celular programada Efecto citostático Efecto citotóxico
30. RESULTADOS Efecto de la MTA y el DIG-MSK en la supervivencia de líneas tumorales LINEA CELULAR IC50 MTA IC50 DIG-MSK H-MEC-1 7 nM 8 nM HUVEC 39,87 nM 47,15 nM A2780 13,57 nM 2,84 nM OVCAR-3 3 nM 6,75 nM IGROV-1 136 nM 7,5 nM SK-OV-3 10,5 nM 16,23 nM MCF-7 99,36 nM 17,26 nM PANC-1 33,83 nM 434,7 nM DLD-1 209,9 nM 180 nM HT-29 1,2 µM 2,56 nM
31. RESULTADOS La MTA y el DIG-MSK inhiben la proliferación celular en líneas tumorales de ovario A2780 13,57 nM 2,84 nM OVCAR-3 3 nM 6,75 nM IGROV-1 136 nM 7,5 nM LINEA CELULAR IC50 MTA IC50 DIG-MSK
32. RESULTADOS La MTA y el DIG-MSK inducen apoptosis en células de cáncer de ovario
33. RESULTADOS MTA y DIG-MSK inhiben la progresión del ciclo celular en células tumorales de ovario
34. RESULTADOS MTA y DIG-MSK REGULAN LA EXPRESIÓN DE GENES IMPLICADOS EN EL PUNTO DE CONTROL DE CAMBIO DE FASE G1 A S G1 atm p53 p21 CDK4/6-Ciclina D CDK2- Ciclina E e2f rb c-myc S mdm2 p14 p16 p27 p57
35. RESULTADOS MTA y DIG-MSK REGULAN LA EXPRESIÓN DE GENES IMPLICADOS EN EL PUNTO DE CONTROL DE CAMBIO DE FASE G1 A S G1 atm p53 p21 CDK4/6-Ciclina D CDK2- Ciclina E e2f rb c-myc S mdm2 p14 p16 p27 p57 cdk6 ciclina D2 cdk6 ciclina D2
36. RESULTADOS MTA y DIG-MSK inhiben la expresión de CDK6 y CCND2 LUC CDK6 LUC CCND2
37. RESULTADOS MTA y DIG-MSK inhiben la expresión de CDK6 y Ciclina D2
38. RESULTADOS MTA y DIG-MSK inhiben la expresión de CDK6 y Ciclina D2
39. DISCUSIÓN DIG-MSK Efecto citostático ➢ CDK6 ➢ Ciclina D2 Efecto citotóxico ➢ No tóxico en PBMCs
40. OBJETIVO 3 1. Dilucidar los mecanismos de acción responsables de su diferente actividad antitumoral y toxicidad de los derivados de la MTA, en particular del DIG-MSK. 2. Estudiar el efecto que producen estos compuestos sobre la supervivencia y la muerte celular, y sobre la regulación del ciclo celular en líneas tumorales de ovario. 3. Evaluar la capacidad antiangiogénica de estas mitramicinas.
41. METODOLOGIA
42. RESULTADOS MTA y DIG-MSK inhiben la supervivencia de las líneas endoteliales HUVEC y H-MEC-1 LINEA CELULAR IC50 MTA IC50 DIG-MSK H-MEC-1 7 nM 8 nM HUVEC 39,87 nM 47,15 nM
43. RESULTADOS MTA y DIG-MSK aumentan la apoptosis de las líneas endoteliales HUVEC y H-MEC-1
44. RESULTADOS MTA y DIG-MSK inhiben la proliferación celular y detienen el ciclo celular en las líneas endoteliales B
45. RESULTADOS MTA y DIG-MSK no afectan a la migración de células endoteliales
46. RESULTADOS DIG-MSK inhibe la formación de vasos sanguíneos
47. MTA y DIG-MSK regulan la expresión de genes pro- y anti-angiogénicos RESULTADOS
48. RESULTADOS MTA y DIG-MSK regulan la expresión de genes pro- y anti-angiogénicos y la expresión en membrana de los receptores de VEGF
49. RESULTADOS MTA y DIG-MSK regulan la expresión de genes pro- y anti-angiogénicos y la expresión en membrana de los receptores de VEGF
50. DISCUSIÓN DIG-MSK Efecto citotóxico Efecto citostático Efecto antiangiogénico
51. CONCLUSIONES 1. Las diferencias estructurales que presenta el compuesto DIG-MSK no involucran una diferencia en su patrón de captación con respecto a la MTA, sin embargo su unión al ADN se realiza de forma más débil y con una especificidad diferente. 2. DIG-MSK retiene la capacidad de la MTA de inhibir la transcripción mediada por Sp1 y de inhibir diversos proto-oncogenes regulados por Sp1 en las líneas tumorales de ovario. 3. DIG-MSK es un inhibidor más potente que la MTA en la transcripción mediada por Sp3 y de la expresión de Sp3 en algunas líneas tumorales de ovario. 4. MTA y DIG-MSK inhiben la supervivencia de diversas líneas tumorales, siendo mayor la producida en las líneas tumorales de ovario. En estas líneas provocan un aumento de la apoptosis. 5. DIG-MSK es cuatro veces menos tóxico que la MTA en células mononucleares de sangre periférica en individuos sanos.
52. 6. MTA y DIG-MSK provocan una detención del ciclo celular en fase G1 en las líneas OVCAR-3 e IGROV-1 que se asocia con una disminución de la expresión de Ciclina D2 y CDK6 a nivel de ARNm y proteína. 7. MTA y DIG-MSK inhiben la supervivencia e inducen muerte celular en las líneas H- MEC-1 y HUVEC. Así mismo, DIG-MSK provoca una parada en fase G1 del ciclo celular en la línea HUVEC, pero no en H-MEC-1, mientras que MTA provoca la parada en fase G1 en ambas líneas endoteliales. 8. Aunque DIG-MSK no posee efecto sobre la migración de las células endoteliales, es capaz de inhibir la formación de estructuras similares a vasos sanguíneos a dosis no tóxicas. 9. MTA y DIG-MSK inhiben la expresión a nivel de ARNm y de proteína de VEGFR1 y VEGFR2 en las líneas HUVEC y H-MEC-1. CONCLUSIONES
53. MUCHAS GRACIAS