Carvalho [email protected] Dep. Biotecnologia Agropecuária e Ambiental XVI CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA MINICURSO: BIOINFORMÁTICA APLICADA AO ESTUDO DE MICROBIOMAS
microbiota é essencial em inúmeros processos. • Digestão de alimentos • Regulação do sistema imune • Combate à patógenos • Produção de vitaminas e nutrientes
• Bactérias, Fungos, Vírus, Arqueias, etc... • Quais as proporções dos membros da comunidades? • O que está fazendo? • Quais reações químicas estão ocorrendo? • Quais produtos estão sendo consumidos e secretados? • Genes expressos • Como está fazendo • Vias metabólicas ativas, proteínas e metabólitos
humano ~ 3.8x1013 • Céls. humanas no corpo humano ~ 3.0x1013 • Céls. procarióticas na biosfera ~ 1030 • Número de estrelas no universo ~ 1022 a 1024 • Número de espécies bacterianas ~ 1011 a 1012 • Número de bactérias cultivadas ~ 104 (2016; https://doi.org/10.1073/pnas.1521291113) > 99,99%
protocolo de Pace et. al.: • Coletar amostra contendo microrganismos • Inocular em placa de cultivo • Sequenciar o que crescer Depois do protocolo de Pace et. al.: • Coletar amostra contendo microrganismos • Extrair e Amplificar o material genético • Sequenciar o produto da amplificação
molecular para o estudo de comunidades microbianas provenientes de ambientes naturais, sem a necessidade de isolamento e cultivo individual das espécies” “Meta”: Maior; Mais complexo; Expandido Handelsman et al., 1998. (https://doi.org/10.1016/s1074-5521(98)90108-9); Chen e Pachet, 2005. (https://dx.doi.org/10.1371%2Fjournal.pcbi.0010024)
• Réplicas • Técnicas e/ou Biológicas? • Escala • Indivíduos ou populações? • Locais ou biomas? • Temporal? • Efeito • Contraste sutil ou consistente? A 1 2 3 A A Adaptado de Franzosa et al., 2015. (https://doi.org/10.1038/nrmicro3451)
OTUs/ASVs Atribuição Taxonômica Predição Funcional • Visualização inicial • Filtragem de bases/leituras de baixa qualidade • Remoção de adaptadores, primers e barcodes • Remoção de contaminantes e quimeras • Fusão de sequências Forward-Reverse (Paired-End)
OTUs/ASVs Atribuição Taxonômica Predição Funcional • OTU: Operational Taxonomic Unit • ASV: Amplicon Sequence Variant Sp.1 Sp.2 Sp.3 Sp.4 Sp.5 Amostra PCR Erros de PCR Quimera ASV 1 ASV 2 ASV 3 ASV 4 ASV 5 Denoising (ASV) Eliminação de erros OTU 1 OTU 3 OTU 2 Clustering (OTU) Incorporação de erros Sequenciamento Erros de Seq. Viés de cobertura
OTUs/ASVs Atribuição Taxonômica Predição Funcional Quem está lá? Alinhamento contra bancos de dados de referências para genes marcadores https://greengenes.secondgenome.com/ http://rdp.cme.msu.edu/ https://www.arb-silva.de/ https://unite.ut.ee/
OTUs/ASVs Atribuição Taxonômica Predição Funcional Langille et. al., 2013. (https://doi.org/10.1038/nbt.2676); Douglas et. al., 2020. (https://doi.org/10.1038/s41587-020-0548-6) O que está fazendo? (ou quase isso) Generalizações a partir das anotações taxonômicas Genes e Vias funcionais Precisão pode ultrapassar os 80%
Atribuição Taxonômica Predição Gênica e Anotação Funcional Fragmentos de tamanhos variáveis • Remoção de seqs. pequenas • Fusão? Contaminante • DNA do hospedeiro • DNA humano
Atribuição Taxonômica Predição Gênica e Anotação Funcional Predizer genes e atribuir funções Estruturas associadas a genes Associar à descrições de vias metabólicas e funções biológicas Gerais Específicos