Introdução a Metagenômica e Metabarcoding

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1. Introdução a Metagenômica e Metabarcoding Me. Lucas Amoroso Lopes de Carvalho lucas.amoroso@unesp.br Dep. Biotecnologia Agropecuária e Ambiental XVI CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA MINICURSO: BIOINFORMÁTICA APLICADA AO ESTUDO DE MICROBIOMAS
2. Sobre o minicurso Prof. Daniel Michelli Lucas Sabrina
3. Sobre o minicurso
4. ❖ O que é um microbioma ❖ Como estudar microbiomas ❖ Aplicações dos estudos de comunidades microbianas Objetivo
5. O que é o microbioma? • Os organismos não vivem de forma axênica • Bactéria, arqueias, fungos, protistas e vírus* • Conhecida como microbiota • Microbioma = ambiente + microbiota
6. O que é o microbioma? Metaorganismo Holobionte https://doi.org/10.26320/SCIENTIA314 https://www.quantamagazine.org/should-evolution-treat-our-microbes-as-part-of-us-20181120/
7. Ikeda-Ohtsubo et al., 2018. (https://doi.org/10.3389/fnut.2018.00090) Altamente específico e especializado
8. Brooks et al., 2016. (https://dx.doi.org/10.1371%2Fjournal.pbio.2000225) Altamente específico e especializado
9. Importância do microbioma • Em um estado de equilíbrio, a microbiota é essencial em inúmeros processos. • Digestão de alimentos • Regulação do sistema imune • Combate à patógenos • Produção de vitaminas e nutrientes
10. Importância do microbioma • Em um estado de equilíbrio, a microbiota é essencial em inúmeros processos. • Fitoestimulação • Tolerância a estresses e doenças • Obtenção de nutrientes
11. Importância do microbioma • Em um estado de equilíbrio, a microbiota é essencial em inúmeros processos. • Decomposição da MO • Ciclagem de nutrientes • Carbono e Nitrogênio • Retenção hídrica • Biorremediação
12. O microbioma é dinâmico • As composições e funções são susceptíveis a variação: • Fatores bióticos – Interações • Fatores abióticos – Alterações do habitat Disbiose pode ocasionar efeitos prejudiciais no hospedeiro
13. O microbioma é dinâmico Múltiplas interações Alterações constantes! Zuniga et al., 2017. (https://doi.org/10.1111/1751-7915.12855)
14. Microbioma: A figura completa Berg et al., 2020. (https://doi.org/10.1186/s40168-020-00875-0)
15. Estudos de microbioma Três grandes perguntas: • Quem está lá? • Bactérias, Fungos, Vírus, Arqueias, etc... • Quais as proporções dos membros da comunidades? • O que está fazendo? • Quais reações químicas estão ocorrendo? • Quais produtos estão sendo consumidos e secretados? • Genes expressos • Como está fazendo • Vias metabólicas ativas, proteínas e metabólitos
16. Como estudar o microbioma? Métodos Dependentes de Cultivo Métodos Independentes de Cultivo
17. Como estudar o microbioma? Métodos Dependentes de Cultivo • Métodos tradicionais Isolamento, cultivo e identificação • Diferenças metabólicas e morfofisiológicas • Macroscópicas (temp. de crescimento, morfologia das colônias...) • Microscópicas (tamanho, formato...) • Provas bioquímicas
18. • População humana ~ 8x109 • Céls. bacterianas no corpo humano ~ 3.8x1013 • Céls. humanas no corpo humano ~ 3.0x1013 • Céls. procarióticas na biosfera ~ 1030 • Número de estrelas no universo ~ 1022 a 1024 • Número de espécies bacterianas ~ 1011 a 1012 • Número de bactérias cultivadas ~ 104 (2016; https://doi.org/10.1073/pnas.1521291113) > 99,99%
19. Como estudar o microbioma? Métodos Dependentes de Cultivo Métodos Independentes de Cultivo
20. Como estudar o microbioma? Obtenção da amostra Extração do material Análise Bioinformática • DNA • RNA • Proteínas • Metabólitos • Sequenciamento (NGS) • Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) • Perfil taxonômico • Perfil funcional • Diversidade • Relações • Etc...
21. Como estudar o microbioma? Genes marcadores DNA RNA Proteínas • Taxonomia • Taxonomia • Funções (s/ expressão) • Taxonomia • + Funções (c/ expressão) • Taxonomia • ++ Funções (c/ expressão) Metabarcoding Metagenômica Metatranscriptômica Metaproteômica
22. Como estudar o microbioma? Vanwonterghem et al., 2014. (https://doi.org/10.1016/j.copbio.2013.11.004)
23. Metagenômica: A origem Alves et al., 2018. (https://doi.org/10.1155/2018/2312987)
24. Metagenômica: A origem Alves et al., 2018. (https://doi.org/10.1155/2018/2312987) Antes do protocolo de Pace et. al.: • Coletar amostra contendo microrganismos • Inocular em placa de cultivo • Sequenciar o que crescer Depois do protocolo de Pace et. al.: • Coletar amostra contendo microrganismos • Extrair e Amplificar o material genético • Sequenciar o produto da amplificação
25. Metagenômica: A origem Alves et al., 2018. (https://doi.org/10.1155/2018/2312987)
26. Metagenômica: A origem Alves et al., 2018. (https://doi.org/10.1155/2018/2312987) Prospecção de bioprodutos
27. Metagenômica: A origem Alves et al., 2018. (https://doi.org/10.1155/2018/2312987)
28. Metagenômica: A origem Alves et al., 2018. (https://doi.org/10.1155/2018/2312987)
29. Metagenômica: A origem Alves et al., 2018. (https://doi.org/10.1155/2018/2312987)
30. Metagenômica: A origem Alves et al., 2018. (https://doi.org/10.1155/2018/2312987)
31. O que é a Metagenômica “Aplicação de técnicas da biologia molecular para o estudo de comunidades microbianas provenientes de ambientes naturais, sem a necessidade de isolamento e cultivo individual das espécies” “Meta”: Maior; Mais complexo; Expandido Handelsman et al., 1998. (https://doi.org/10.1016/s1074-5521(98)90108-9); Chen e Pachet, 2005. (https://dx.doi.org/10.1371%2Fjournal.pcbi.0010024)
32. O que é a Metagenômica Genômica Linhagens puras Metagenômica Comunidades
33. O que é a Metagenômica Sequenciamento Montagem
34. O que é a Metagenômica Sequenciamento Montagem
35. Etapas da Metagenômica Coleta e Extração Preparação das bibliotecas Sequenciamento Análises Bioinformáticas
36. Delineamento experimental • Tipo de estudo • Caracterização ou Comparação? • Réplicas? • Técnicas e/ou Biológicas? • Escala • Indivíduos ou populações? • Locais ou biomas? • Temporal? • Efeito • Contraste sutil ou consistente? Adaptado de Franzosa et al., 2015. (https://doi.org/10.1038/nrmicro3451)
37. Delineamento experimental • Tipo de estudo • Caracterização ou Comparação? • Réplicas • Técnicas e/ou Biológicas? • Escala • Indivíduos ou populações? • Locais ou biomas? • Temporal? • Efeito • Contraste sutil ou consistente? Adaptado de Franzosa et al., 2015. (https://doi.org/10.1038/nrmicro3451)
38. Delineamento experimental • Tipo de estudo • Caracterização ou Comparação? • Réplicas • Técnicas e/ou Biológicas? • Escala • Indivíduos ou populações? • Locais ou biomas? • Temporal? • Efeito • Contraste sutil ou consistente? A 1 2 3 A A Adaptado de Franzosa et al., 2015. (https://doi.org/10.1038/nrmicro3451)
39. Delineamento experimental • Tipo de estudo • Caracterização ou Comparação? • Réplicas • Técnicas e/ou Biológicas? • Escala • Indivíduos ou populações? • Locais ou biomas? • Temporal? • Efeito • Contraste sutil ou pronunciado? Adaptado de Franzosa et al., 2015. (https://doi.org/10.1038/nrmicro3451)
40. Coleta e Extração
41. Coleta e Extração Claesson et al., 2017. (https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.97)
42. Coleta e Extração Bag et al., 2016. (https://doi.org/10.1038/srep26775) Variação em diversidade
43. Coleta e Extração Utilização de kits específicos Francioli et al., 2021. (https://doi.org/10.3390/microorganisms9020361) Sui et al., 2020. (https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00953)
44. Preparação das bibliotecas: Metagenômica vs. Metabarcoding Fragmentação PCR DNA metagenômico Amplificação de um gene marcador Fragmentos aleatórios dos genomas completos
45. Metabarcoding (ou Metataxonômica, ou Análise de amplicons...) Organism group Marker gene/locus Animals COI, Cytb, 12S, 16S Plants matK, rbcL, psbA-trnH, ITS Bacteria 16S, COI, rpoB, cpn60, tuf, RIF, gnd Fungi ITS, TEF1α, RPB1, RPB2, 18S, 28S Protists ITS, COI, rbcL, 18S, 28S, 23S Purty e Chatterjee, 2016. (https://austinpublishinggroup.com/biotechnology-bioengineering/fulltext/ajbtbe-v3-id1059.php) Regiões conservadas e variadas
46. Metabarcoding Gene 16S rRNA Yang et al., 2016. (https://doi.org/10.1186/s12859-016-0992-y)
47. Metabarcoding Gene 16S rRNA 16S completo V1-V5 V1-V3 Bag et al., 2016. (https://doi.org/10.1038/srep26775) 1ª - Água residual 2ª - Solo 3ª - Fezes 4ª - Swab vaginal 5ª - Biópsia de tecido gástrico
48. Metabarcoding 16S ITS 18S Francioli et al., 2021. (https://doi.org/10.3390/microorganisms9020361)
49. Preparação das bibliotecas: Metagenômica vs. Metabarcoding Fragmentação PCR DNA metagenômico Amplificação de um gene marcador Fragmentos aleatórios dos genomas completos Sequenciamento
50. Sequenciamento • Tamanho ⭐⭐ ⭐ ⭐⭐⭐ • Rendimento ⭐ ⭐⭐⭐ ⭐
51. Sequenciamento Segerman, 2020. (https://doi.org/10.3389/fcimb.2020.527102)
52. Sequenciamento NGS Sequenciamento por síntese (Illumina)
53. Sequenciamento NGS Sequenciamento por síntese (Illumina)
54. Sequenciamento NGS
55. Sequenciamento NGS Estratégia Paired-end
56. Sequenciamento: Cobertura 10 a 100x
57. Sequenciamento: Cobertura • 15Gb = 15.000.000.000 • 15Gb / 2 * 150 (300bp) / 100 amostras = 500.000 por amostra (2 * 250.000 Bib.) Bom ou ruim?
58. Sequenciamento: Cobertura E quando trabalhamos com metagenomas? Abundância diferencial Diversidade Cobertura necessária pode ser absurdamente alta!
59. Sequenciamento: Cobertura E quando trabalhamos com metagenomas? https://gold.jgi.doe.gov/statistics
60. Sequenciamento: Cobertura Metagenômica vs. Metabarcoding Menor cobertura necessária Tessler et. al., 2017. (https://doi.org/10.1038/s41598-017-06665-3) Rios brasileiros Shotgun vs Amplicon
61. Ao final do sequenciamento... Amostra1.fastq Amostra2.fastq Amostra3.fastq Amostra4.fastq Bioinformática Amostra 1 Amostra 2 ... SP1 19 34 ... SP2 33 87 ... ... ... ... ... Táxons Amostra 1 Amostra 2 ... G1 178 678 ... G2 567 554 ... ... ... ... ... Genes
62. Análises bioinformáticas Metagenômica Metabarcoding Pérez-Cobas et. al., 2020. (https://doi.org/10.1099/mgen.0.000409) Análises de microbioma
63. Análises bioinformáticas Metagenômica Metabarcoding Pérez-Cobas et. al., 2020. (https://doi.org/10.1099/mgen.0.000409) Análises de microbioma
64. Análises bioinformáticas Metabarcoding Controle de Qualidade Leituras Brutas Estimação de OTUs/ASVs Atribuição Taxonômica Predição Funcional
65. Análises bioinformáticas Metabarcoding Controle de Qualidade Leituras Brutas Estimação de OTUs/ASVs Atribuição Taxonômica Predição Funcional • Visualização inicial • Filtragem de bases/leituras de baixa qualidade • Remoção de adaptadores, primers e barcodes • Remoção de contaminantes e quimeras • Fusão de sequências Forward-Reverse (Paired-End)
66. Análises bioinformáticas Metabarcoding Controle de Qualidade Leituras Brutas Estimação de OTUs/ASVs Atribuição Taxonômica Predição Funcional • OTU: Operational Taxonomic Unit • ASV: Amplicon Sequence Variant Sp.1 Sp.2 Sp.3 Sp.4 Sp.5 Amostra PCR Erros de PCR Quimera ASV 1 ASV 2 ASV 3 ASV 4 ASV 5 Denoising (ASV) Eliminação de erros OTU 1 OTU 3 OTU 2 Clustering (OTU) Incorporação de erros Sequenciamento Erros de Seq. Viés de cobertura
67. Análises bioinformáticas Metabarcoding Controle de Qualidade Leituras Brutas Estimação de OTUs/ASVs Atribuição Taxonômica Predição Funcional Sample 1 Sample 1 Sample 2 Sample 2 Sample 3 Sample 3 Sample 4 Sample 4
68. Análises bioinformáticas Metabarcoding Controle de Qualidade Leituras Brutas Estimação de OTUs/ASVs Atribuição Taxonômica Predição Funcional Quem está lá? Alinhamento contra bancos de dados de referências para genes marcadores https://greengenes.secondgenome.com/ http://rdp.cme.msu.edu/ https://www.arb-silva.de/ https://unite.ut.ee/
69. Análises bioinformáticas Metabarcoding Controle de Qualidade Leituras Brutas Estimação de OTUs/ASVs Atribuição Taxonômica Predição Funcional Langille et. al., 2013. (https://doi.org/10.1038/nbt.2676); Douglas et. al., 2020. (https://doi.org/10.1038/s41587-020-0548-6) O que está fazendo? (ou quase isso) Generalizações a partir das anotações taxonômicas Genes e Vias funcionais Precisão pode ultrapassar os 80%
70. Análises bioinformáticas Metagenômica Metabarcoding Pérez-Cobas et. al., 2020. (https://doi.org/10.1099/mgen.0.000409) Análises de microbioma
71. Análises bioinformáticas Metagenômica Controle de Qualidade Leituras Brutas Montagem Binning Atribuição Taxonômica Predição Gênica e Anotação Funcional Independente de montagem
72. Análises bioinformáticas Metagenômica Controle de Qualidade Leituras Brutas Montagem Binning Atribuição Taxonômica Predição Gênica e Anotação Funcional Fragmentos de tamanhos variáveis • Remoção de seqs. pequenas • Fusão? Contaminante • DNA do hospedeiro • DNA humano
73. Análises bioinformáticas Metagenômica Controle de Qualidade Leituras Brutas Montagem Binning Atribuição Taxonômica Predição Gênica e Anotação Funcional Fragmentação Sequenciamento Montagem
74. Análises bioinformáticas Metagenômica Controle de Qualidade Leituras Brutas Montagem Binning Atribuição Taxonômica Predição Gênica e Anotação Funcional 50x 10x MAGs Metagenome-Assembled Genomes
75. Análises bioinformáticas Metagenômica Controle de Qualidade Leituras Brutas Montagem Binning Atribuição Taxonômica Predição Gênica e Anotação Funcional Reference Genomes Wood e Salzberg, 2014. (https://doi.org/10.1186/gb-2014-15-3-r46)
76. Análises bioinformáticas Metagenômica Controle de Qualidade Leituras Brutas Montagem Binning Atribuição Taxonômica Predição Gênica e Anotação Funcional Predizer genes e atribuir funções Estruturas associadas a genes Associar à descrições de vias metabólicas e funções biológicas Gerais Específicos
77. Análises bioinformáticas Metagenômica Metabarcoding Pérez-Cobas et. al., 2020. (https://doi.org/10.1099/mgen.0.000409) Análises de microbioma
78. Análises bioinformáticas Visualizações e Análises estatísticas Liu et. al., 2021. (https://doi.org/10.1007/s13238-020-00724-8) Análises ecológicas Alfa e Beta diversidade Abundância diferencial Táxons e funções Análises de Redes Estrutura Modelos de predição Perfil taxonômico e funcional Correlações Metadados Filogenia Relações evolutivas
79. Análises bioinformáticas Metagenômica vs. Metabarcoding Cobertura Custo Quantidade de DNA Recursos computacionais Dados
80. Análises bioinformáticas Metagenômica vs. Metabarcoding Cobertura Custo Quantidade de DNA Recursos computacionais Dados
81. Análises bioinformáticas Metagenômica vs. Metabarcoding Cobertura Custo Quantidade de DNA Recursos computacionais Dados
82. Análises bioinformáticas Metagenômica vs. Metabarcoding Cobertura Custo Quantidade de DNA Recursos computacionais Dados
83. Análises bioinformáticas Metagenômica vs. Metabarcoding Cobertura Custo Quantidade de DNA Recursos computacionais Dados
84. Aplicações Agricultura Energia Saúde Alimentos Ambiente Biotec.
85. Aplicações https://hmpdacc.org/hmp/ 2007 - 2016 Fase 1 Fase 2
86. Aplicações https://hmpdacc.org/hmp/ 2007 - 2016 The Integrative HMP (iHMP) Research Network Consortium, 2019 (https://doi.org/10.1038/s41586-019-1238-8)
87. Aplicações
88. Aplicações Ottman et. al., 2012 (https://doi.org/10.3389/fcimb.2012.00104)
89. Aplicações Quem, o que e como Ezzeldin et. al., 2019 (https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.9b00301)
90. Aplicações https://earthmicrobiome.org/ Caracterizar a diversidade taxonômica e funcional do planeta Thompson et. al., 2017 (https://doi.org/10.1038/nature24621)
91. Thompson et. al., 2017 (https://doi.org/10.1038/nature24621)
92. Nayfach et. al., 2021 (https://doi.org/10.1038/s41587-020-0718-6) Aplicações
93. Aplicações http://metasub.org/ Caracterizar a diversidade taxonômica e funcional das cidades Thompson et. al., 2017 (https://doi.org/10.1038/nature24621)
94. Danko et. al., 2021 (https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.05.002)
95. de Souza et. al., 2016 (https://doi.org/10.1038/srep28774); Armanhi et. al., 2016 (https://doi.org/10.1038/srep29543); Armanhi et. al., 2018 (https://doi.org/10.3389/fpls.2017.02191) Aplicações Agricultura e comunidades sintéticas
96. de Souza et. al., 2016 (https://doi.org/10.1038/srep28774)
97. Armanhi et. al., 2016 (https://doi.org/10.1038/srep29543)
98. Armanhi et. al., 2018 (https://doi.org/10.3389/fpls.2017.02191)
99. Empresas que aplicam... A Bioma4me, empresa pioneira de sequenciamentos de microbioma humano no Brasil
100. Empresas que aplicam...
101. Prática https://hackmd.io/@lamoroso92/minigen22-intro Microbiota do morango ▪ 16S rRNA (V4) ▪ Estudo comparativo ▪ Presença de patógenos de solo - Macrophomina phaseolina - Verticillium dahliae