Củ tam thất bắc điều trị ung thư

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN
THỊ HUẾ BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M. Feng) TRỒNG TẠI SAPA – LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người
thực hiện: NGUYỄN THỊ HUẾ BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatusH.T.Tsai et K.M. Feng)TRỒNG TẠI SAPA – LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. ĐỖ THỊ HÀ 2. PGS.TS. DƯƠNG THỊ LY HƯƠNG Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN Đầu tiên tôi xin gửi lời cám
ơn đến toàn thể Ban Giám hiệu Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội và Bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng đã tạo điều kiện cho tôi được làm khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt, giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm qua. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến PGS.TS. Đỗ Thị Hà, PGS.TS. Dương Thị Ly Hương, DS. Phạm Thị Thúy, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu Khoa Hoá Thực vật - Viện Dược liệu, các thầy cô ở Bộ môn Thực Vật- Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn đề tài cấp Nhà nước: “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) vùng Tây Bắc”,mã số: KHCN-TB.07C/13-18, 2015- 2017 (Chương trình Tây Bắc) đã tài trợ kinh phí để tôi thực hiện nội dung nghiên cứu này. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu tôi khó tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô để khoá luận thêm hoàn thiện. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Huế

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải
nghĩa DĐVN IV Dược điển Việt Nam 4 HCT-116 Dòng tế bào ung thư ruột kết người 116 HepG2 Tế bà ung thư gan HepG2 HL-60 Dòng tế bào ung thư bạch cầu người 60 HPLC-MS/MS Sắc ký lỏng hiệu năng cao – phổ khối/ phổ khối IC50 Nồng độ ức chế 50% LD50 Liều gây chết 50% NF-κB Yếu tố nhân kappa B P. Panax Rf Hệ số di chuyển RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TT Thuốc thử TTH Tam thất hoang

DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1 Phân
bố của các loài thuộc chi Panax L. 2 Bảng 2 Saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol và 20(S)- protopanaxatriol 4 Bảng 3 Saponin khung dammaran khác 5 Bảng 4 Saponin dẫn chất ocotillol 5 Bảng 5 Saponin dẫn chất acid oleanolic 6 Bảng 6 Các polyacetylen trong một số loài thuộc chi Panax L. 6 Bảng 7 Các hợp chất saponin đã phân lập được từ tam thất hoang 10 Bảng 8 Độ ẩm của dược liệu tam thất hoang 27 Bảng 9 Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu tam thất hoang 28 Bảng 10 Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu tam thất hoang 28 Bảng 11 Hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu tam thất hoang 30 Bảng 12 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng tới mật độ quang 32 Bảng 13 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới mật độ quang 32 Bảng 14 Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin 33 Bảng 15 Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloeric 34 Bảng 16 Độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn 36 Bảng 17 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đo quang 37 Bảng 18 Kết quả xác định độ đúng của phương pháp 38 Bảng 19 Kết quả định lượng saponin tổng trong một số mẫu tam thất hoang 38

DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1 Tam
thất hoang 9 Hình 2 Saponin dẫn chất acid oleanolic 10 Hình 3 Nguyên liệu tam thất hoang (Panax stipuleanatusH.T. Tsai etK.M. Feng) tươi 16 Hình 4 Vi phẫu lá 23 Hình 5 Vi phẫu thân 24 Hình 6 Vi phẫu thân rễ 25 Hình 7 Bột lá 26 Hình 8 Bột thân 26 Hình 9 Bột thân rễ 27 Hình 10 Sắc ký đồ của dịch chiết tam thất hoang (B) và chất chuẩn stipuleanosid R1(06) và stipuleanosid R2 (05) 29 Hình 11 Phổ hấp thụ của các dung dịch trong khoảng bước sóng từ 300 – 800nm 31 Hình 12 Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới mật độ quang 32 Hình 13 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới mật độ quang 33 Hình 14 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin 34 Hình 15 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloric 35 Hình 16 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ chất chuẩn tại bước sóng 550 nm 36

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1 -
TỔNG QUAN ................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về chi Panax............................................................................................. 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật ............................................................................................. 2 1.1.2. Thành phần hóa học .......................................................................................... 4 1.1.3. Tác dụng dược lý .............................................................................................. 8 1.2. Tổng quan về dược liệu tam thất hoang ..................................................................... 9 1.2.1. Thực vật học ..................................................................................................... 9 1.2.2. Thành phần hóa học ........................................................................................ 10 1.2.3. Tác dụng dược lý và công dụng ..................................................................... 12 1.3. Tổng quan về tiêu chuẩn dược liệu .......................................................................... 13 CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 16 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và máy móc, thiết bị ............................................................. 16 2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................... 17 2.2.1. Mô tả ............................................................................................................... 17 2.2.2. Vi phẫu ........................................................................................................... 17 2.2.3. Soi bột ............................................................................................................. 17 2.2.4. Độ ẩm ............................................................................................................. 17 2.2.5. Tro toàn phần .................................................................................................. 17 2.2.6. Tro không tan trong acid ................................................................................ 17 2.2.7. Định tính ......................................................................................................... 18 2.2.8. Định lượng ...................................................................................................... 19 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................... 22 3.1. Đặc điểm vi phẫu và bột........................................................................................ 22 3.1.1. Đặc điểm vi phẫu ............................................................................................ 22 3.1.2. Đặc điểm bột dược liệu ................................................................................... 25 3.2. Độ ẩm ....................................................................................................................... 27 3.3. Tro toàn phần ........................................................................................................... 28

3.4. Tro không tan trong acid .......................................................................................... 28 3.5. Định
tính .................................................................................................................. 29 3.6. Định lượng ............................................................................................................... 30 3.6.1. Định lượng theo phương pháp cân ................................................................. 30 3.6.2. Định lượng theo phương pháp đo quang ........................................................ 30 3.7. Bàn luận ................................................................................................................... 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 41 Kết luận ........................................................................................................................... 41 Kiến nghị ......................................................................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 42 PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC .......................................... i PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU ............................ TAM THẤT HOANG .............................................................................................. ii

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhắc đến thảo dược, người ta
không thể không nhắc đến “Sâm”. Ngày nay, thuật ngữ“Sâm” không chỉ dùng để chỉ cây nhân sâm (Panax ginseng C.A. Meyer), mà còn để gọi chung cho rất nhiều loài thuộc chi Panax L. bởi chúng có những tác dụng quý tương tự. Nhiều loài trong chi Sâm (Panax), đặc biệt là các loài nhân sâm (Panax ginseng C.A. Meyer), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen ex C.Y. Wu et K.M. Feng; syn.: P. pseudoginseng all.), sâm Nhật (Panax japonicus C.A.Meyer), sâm Mỹ (Panax quynquefolius L.), sâm Siberia (AcanthoPanax senticosus (Rupr. et Maxim.) Harms; syn.: Eleutherococcus senticosus Maxim.)..., là những cây thuốc quý, được ưa chuộng, rất nổi tiếng và có giá trị cao[14]. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M. Feng) đã được ghi nhận trong các tài liệu cây thuốc và được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian, đặc biệt là các dân tộc miền núi Tây Bắc. Tuy nhiên, cho đến thời điểm này, ở nước ta và cả trên thế giới những nghiên cứu về loại sâm này là rất ít và tản mạn.Tam thất hoang được sử dụng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress, kích thích tiêu hóa, an thần...[3] nhưng lại là loài quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng cao ở Việt Nam[15]. Ngày nay, các nguyên liệu dược liệu đang bị làm giả làm nhái rất nhiều và nhiều chế phẩm từ dược liệu còn kém chất lượng, tam thất hoang càng không phải một ngoại lệ. Điều này có thể làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người, cũng như gây mất lòng tin của người sử dụng với thuốc và chế phẩm từ dược liệu. Vì vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu là hết sức cần thiết. Cho đến nay, dược liệu tam thất hoang vẫn chưa được đưa vào dược điển Việt Nam, các dược điển Trung Quốc, Ấn Độ cũng chưa có chuyên luận cho dược liệu này. Do vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài : “Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M. Feng)trồng tại Sapa – Lào Cai” với mục tiêu: Xây dựngđược các tiêu chuẩn cho dược liệu tam thất hoang trồng tại Sa Pa– Lào Cai. Để đạt được mục tiêu trên đề tài thực hiện các nội dung sau: - Phân tích đặc điểm vi học dược liệu. - Xây dựng phương pháp định lượng dược liệu. - Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu với một số tiêu chí chung trong Dược điển Việt Nam IV.

2 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về
chi Panax 1.1.1. Đặc điểm thực vật a) Phân loại và phân bố: Vị trí phân loại của chi PanaxL. theo Takhtajan[72]: Giới: Thực vật - Plantae Ngành: Ngọc lan- Magnoliophyta. Lớp: Ngọc lan- Magnoliopsida. Bộ: Hoa tán Apiales. Họ: Ngũ gia bì(nhân sâm) Araliaceae Chi: Sâm Panax L. Cho đến nay, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu về các loài thuộc chi Panax. Theo Flora of China (2007)[81], ở Trung Quốc chi Panax có 7 loài. Theo trang The plant list, chi Panax bao gồm 47 tên khoa học của thực vật, trong đó có 12 loài và 1 thứ được chấp nhận với mức độ tin cậy cao. Phân bố của 12 loài như trong bảng sau: Bảng 1. Phân bố của các loài thuộc chi Panax L. STT Loài Phân bố 1 Panax bipinnatifidus Seem. Từ dãy Himalaya đến miền trung Trung Quốc, cũng tìm thấy ở Việt Nam. 2 Panax ginseng C.A.Mey Vùng Viễn đông Nga, Hàn Quốc, Đông bắc Trung Quốc. 3 Panax japonicus (T.Nees) C.A.Mey Nhật Bản, Hàn Quốc. 4 Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen Miền nam Trung Quốc và một số nơi ở Việt Nam. 5 Panax pseudoginseng Wall. Nê-pan. 6 Panax quinquefolius L. Canada, Mỹ.

3 7 Panax sokpayensis Shiva K.Sharma & Pandit Vùng Sikkim
- Ấn Độ. 8 Panax stipuleanatus Tsai & Feng Trung Quốc, Việt Nam. 9 Panax trifolius L. Bắc Mỹ. 10 Panax vietnamensis Ha & Grushv. Trung Quốc, Việt Nam. 11 Panax wangianus S.C.Sun Miền trung, nam Trung Quốc. 12 Panax zingiberensis C.Y.Wu & Feng Vân Nam - Trung Quốc. Ở Việt Nam, chi PanaxL. có 5 loài gồm cây mọc tự nhiên cũng như được nuôi trồng, với phân bố như sau[3]: Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.): ở Quảng Nam, Kon Tum, Gia Lai, Lâm Đồng. Sâm vũ diệp (Panax bipinatifidus Seem.): ở Lào Cai trên dãy Hoàng Liên Sơn, Sa Pa. Tam thất (Panax pseudoginseng Wall.): ở Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn, Phó Bảng, Hà Giang, Lai Châu. Nhân sâm (Panax ginseng Meyer.): phân bố rải rác ở các khu vực rừng núi trong cả nước, mọc tập trung nhiều tại các khu vực vùng núi cao, có khí hậu mát lạnh. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M. Feng): có ở Lai Châu, Lào Cai. b) Đặc điểm thực vật Theo Seemann (1868), chi Panaxlà nhóm thảo mộc có lá kép hình chân vịt có răng cưa, mọc ở đỉnh thân, cụm hoa mang một tán đơn ở tận cùng, hoa nhỏ có 5 cánh, bầu nhụy có 2 hoặc 3 lá noãn, quả mọng khi chín màu đỏ hoặc cam, có 2 – 5 hạt. Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tùy theo số năm sinh trưởng[68]. Quả mọng, hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn[81].

4 1.1.2. Thành phần hóa học Thành phần hóa học
trong các loài thuộc chi Panax rất phong phú[13]: saponin, polyacetylen, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ, đường khử và một số hợp chất mới được phát hiện như glycosphingolipid, saccharose [6] …Trong đó saponin và polyacetylen là hai thành phần chính. a) Hợp chất saponin Saponin được xem là thành phần chính quyết định hoạt tính của các loài thuộc chi Panax. Đến cuối năm 2012, ít nhất 289 saponin đã được báo cáo từ mười một loài Panax khác nhau[79]. Các saponin thuộc 4 phân nhóm phổ biến nhất là protopanaxadiol, protopanaxatriol, acid oleanolic, octrilol. Các loại saponin được trình bày trong các bảng dưới đây: Bảng 2. Saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol và 20(S)-protopanaxatriol OH R2 O R1 O OH R2 O HO OR1 R1 =R2 =H: 20(S)-protopanaxadiol R1 =R2 =H: 20(S)-protopanaxatriol STT Tên Kiểu R1 R2 Loài 1 Ginsenosid Rb1 (A) G1C2-G1C G1C6-G1C P. ginseng [60]; P. notoginseng [82] 2 Ginsenosid Rb2 (A) G1C2-G1C Glc6-Ara(p) P. ginseng [84]; P. notoginseng [62] 3 Notoginsenosid R4 (A) G1C2-G1C G1C6-G1C6- Xyl P. notoginseng [55] 4 Notoginsenosid Fa (A) Glc2-Glc2- Xyl Glc6- Glc P. notoginseng [55] 5 Ginsenosid Rgl (B) Glc Glc P. ginseng[79] 6 Notoginsenosid R1 (B) Xyl Glc P. notoginseng [42] 7 Notoginsenosid R3 (B) Glc G1C6-G1C P. notoginseng [55] B A

5 Bảng 3. Saponin khung dammaran khác R1 O OR3
R4 O R2 R1 O OR3 R4 O R2 OH OR3 R4 O R1 O OH R2 R1 O R4 O O STT Tên Loại R1 R2 R3 R4 Loài 1 Majonosid F4 (A) Glc H H Glc P. vietnamensis [45] 2 Chikusetsusaponin L9a (A) H OH H H P. japonicus [70] 5 Chikusetsusaponin L9bc (C) H OH Glc H P. vietnamensis [56] 6 Ginsenosid M7cd (C) H OH H Glc P. vietnamensis [56] 7 Chikusetsusaponin LT8 (D) Glc - - Glc P. japonicus [48] Bảng 4. Saponin dẫn chất ocotillol HO OR O OH OH HO OR O OH OH STT Tên Kiểu R Loài D C A B A B

6 1 PseudoginsenosidF11 (A) Glc2-Rha P. quinquefolius [78] 2 Pseudoginsenosid
RT4 (B) Glc P. japonicus [49] 3 Majonosid-R1 (B) Glc2-Glc P. japonicus [45] 4 Majonosid-R2 (B) Glc2-Xyl P. japonicus [45] Bảng 5. Saponin dẫn chất acid oleanolic OR R1 O COOR2 STT Tên R1 R2 Loài 1 Zingibrosid R1 Glc A2- Glc H P. zingiberensis [37] 2 Stipuleanosid R1 Glc A3- Glc \ 4-Ara(f) H P. stipuleanatus [83] 3 Stipuleanosid R2 Glc A3- Glc \ 4-Ara(f) Glc P. stipuleanatus [83] b) Hợp chất polyacetylen Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon với những nhóm chất liên kết. Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một đầu là nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại của hợp chất là chuỗi C7 H15 [25,52,66]. Bảng 6. Các polyacetylen trong một số loài thuộc chi Panax L. STT Loài Hợp chất TLTK

7 1 P. quinquefolium - Panaxynol - Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol - Heptadeca-l-en-9,10-epoxy-4,6-diyn-3,8-diol
- 3-oxo-9,10-epoxy-heptadeca-1 -en-4,6-diyn - 6,7-epoxy-13-tetradecen-1,3-diyn - 1,2,9,10-diepoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on [33] 2 P.stipuleanatus - stipudiol - stipuol - (3R,9R,10R)- Panaxytriol [23] 3 P. ginseng - Panaxynol (falcarinol) - Panaxytriol - Panaxydol - Heptadeca-1 -en-4,6-diyn-3,9-diol - Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol - Heptadeco-1,4-dien-6,8-diyn-3,10-diol - Panaxacol - 9,10- epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3ol - 10-cloro-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3,9,10-triol - 9,10- epoxy-4,6-heptadecadiyn-3-on - 9,10-epoxy-1 -heptadecen-4,6-diyn-3-on - 3-acetoxy-9,10-epoxy-l,16-heptadecadien-4,6- diyn - 3-acetoxy-9,10-epoxy-4,6-heptadecadiyn - 3-acetoxy-9,10-epoxy-16-heptadecen-4,6-diyn [34,38,67] 4 P. notoginseng - Panaxatriol - Panaxynol - Panaxydol - notoginsenic acid β-sophoroside - 10-hydroxydeca- 4,6-diynoic acid 10-O-β-D- glucopyranosyl (1 -> 2)-β-Dglucopyranoside [77]

8 5 P. vietnamensis - Panaxynol - 10-acetoxy-hetadeca-8 (E) -en-4,6-diyn-3-ol
- Heptadeca-1,8 (E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol - Heptadeca-1,8(Z)-dien-4,6-diyn-3,10-diol - Heptadeca-1,8(E), 10 (Z)-trien-4,6-diyn-3,12-diol [12] 1.1.3. Tác dụng dược lý Trong chi PanaxL., có một số loài đã được nghiên cứu nhiều về tác dụng dược lý như: nhân sâm (Panax ginseng), tam thất (Panax notoginseng), sâm Mỹ (Panax quinquefolius), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis). a) Nhân sâm Nhân sâm đã được nghiên cứu và chứng minh có các tác dụng: tăng lực, hồi phục sức khỏe [76]; cải thiện trí nhớ [59,85]; chống stress, giải lo âu và chống trầm cảm [46,65,76,80]; chống oxy hoá và chống lão hoá [39,54]; bảo vệ gan [35,36,47]; điều hòa miễn dịch[40,41]; chống ung thư [57,69]; hạ cholesterol và lipid máu [23,61]; tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục [29-31]; hạ glucose huyết [44]. b) Tam thất Tam thất cũng thể hiện các tác dụng dược lý tương tự nhân sâm, như: tác dụng chống oxy hóa [75]; tác dụng điều hòa miễn dịch [51]; tác dụng bảo vệ tế bào não trong trường hợp thiểu năng tuần hoàn não [43]; hạ lipid máu và phòng chống huyết khối [32]; tác dụng bảo vệ gan [24,53]; tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục [63]. c) Sâm Mỹ Sâm Mỹ có tác dụng chống oxy hoá, chống stress[50]; tăng cường miễn dịch [28]; gây độc tế bào ung thư [22,64]; chống đái tháo đường [21]. d) Sâm Việt Nam Các công trình nghiên cứu dược lý và lâm sàng cho thấy sâm Việt Nam có những tác dụng tương tự nhân sâm. Các nghiên cứu chỉ ra rằng sâm Việt Nam có tác dụng cải thiện trí nhớ [8,18]; chống stress và trầm cảm [9,19,58]; chống oxy hóa [19]; tác dụng bảo vệ gan [7,73,74]; kháng khuẩn trên các chủng Streptococcus, Staphylococcus[4,52]; kích thích miễn dịch [10]; gây độc tế bào ung thư [71]; tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục, chống đái tháo đường, giảm đau chống viêm [4].

9 1.2. Tổng quan về dược liệu tam thất hoang
1.2.1. Thực vật học Tam thất hoang còn gọi là dã tam thất, Tam thất rừng, Sâm tam thất, Bình biên tam thất. Tên khoa học: Panax stipuleanatusH.T. Tsai et K.M. Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) Araliaceae. Đặc điểm thực vật [3]: Tam thất hoang thuộc cây thảo, sống lâu năm, cao 25-75 cm; thân rễ mập, nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá, ít khi 2-3. Lá kép chân vịt, gồm 1-3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5-10 cm. Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5-13 cm, rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô. Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ. Quả gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng. Hình 1. Tam thất hoang Sinh học và sinh thái: Mùa hoa tháng 4-5, quả tháng 5-9 (10). Nhân giống tự nhiên chủ yếu bằng hạt. Quả chín thường bị chim ăn, hạt rơi xuống đất lại bị loại sóc nhỏ ăn nhân hạt. Cá biệt trong tự nhiên, quả chín tồn tại đến tháng 9 hoặc tháng 10. Cây có thể tái sinh tự nhiên bằng hạt, quả chín rụng ngay xuống đất, xung quanh gốc cây mẹ, nếu không bị tác động, hạt sẽ nảy mầm vào tháng 3 năm sau [16]. Phần thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc lên từ đầu thân rễ, vào đầu mùa xuân năm sau. Khi thân rễ bị gãy, phần đầu mầm còn lại có khả năng tiếp tục tái sinh. Cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác trên đất có nhiều mùn, dưới tán

10 rừng kín thường xanh ẩm, hoặc rừng có xen
lẫn với sặt gai, ở độ cao từ 1600- 2300m[3]. Phân bố:Cho đến nay, loài này mới chỉ tìm thấy ở Đông-Nam tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc Gia Hoàng Liên thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam(Sa Pa và Bát Xát: núi Hoàng Liên Sơn)[16]. 1.2.2. Thành phần hóa học Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của TTH. Một số nghiên cứu tập trung vào phần thân rễ của loài này chỉ ra rằng phần thân rễ TTH chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp. Năm 1985, nhóm các nhà nghiên cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin loại dẫn chất acid oleanolic và đặt tên là stipuleanosid R1 và stipuleanosid R2 từ thân rễ TTH [83]. OR R1 O COOR2 Hình 2. Saponin dẫn chất acid oleanolic Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama (Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol của TTH được thu hái ở Trung Quốc [86]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun L. đã phân lập được 11 hợp chất saponin từ mẫu TTH thu hái ở Việt Nam [26]. Năm 2013, nhóm tiếp tục phân lập được 4 hợp chất saponin khác nữa [27]. Các saponin mà nhóm tác giả trên phân lập được từ TTH đều là các saponin dẫn chất của acid oleanolic. Bảng 7. Các hợp chất saponin đã phân lập được từ tam thất hoang STT Hợp chất TLTK 1 Stipuleanosid R1 (1) [83]

11 2 Stipuleanosid R2 (2) [83] 3 Aralosid A methyl
este (3) [26] 4 Chikusetsusaponin IVa (4) [26] 5 Pseudoginsenosid Rp1 methyl este (5) [26] 6 Pseudoginsenosid Rt1 (6) [26] 7 Pseudoginsenosid Rt1 methyl este (7) [26] 8 Acid oleanolic-3-O-[β-D-glucopyranosyl(1→3)β-D- glucuronopyranosyl-6'-methyl ester] -28-O-β-D- glucopyranosyl ester (8) [26] 9 Acid oleanolic-3-O-β-D-xylopyranosyl(1→2)-β-D- glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosid (9) [26] 10 Spinasaponin A 28-O-glucosid (10) [26] 11 Spinasaponin A methyl este (11) [26] 12 Stipuleanosid R2 methyl este (12) [26] 13 Ginsenosid Rb1 (13) [86] 14 Ginsenosid Rb3 (14) [86] 15 Ginsenosid Rc (15) [86] 16 Ginsenosid Rd (16) [86] 17 Hemslosid Ma2 (17) [27] 18 Elatosid A (18) [27] 19 Stipuleanosid R1 methyl este (19) [27] 20 Acid oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl este (20) [27] Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã phân lập được một số hợp chất khác từ TTH gồm 3 polyacetylen (trong đó stipudiol và stipuol là 2 chất mới, (3R,9R,10R)- panaxytriol là chất đã biết), và các hợp chất khác: spathulenol (serquiterpen) và 9- docosenoic acid methyl ester (acid béo) [25]. Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học của TTH vẫn còn mới mẻ. Năm 2002, Trần Công Luận đã phát hiện sự có mặt của hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin, tanin bằng phương pháp thử định tính hóa học và phân tích sơ bộ sắc ký lớp mỏng[11]. Đồng thời bằng cách thủy phân saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu được acid oleanolic[13].

12 1.2.3. Tác dụng dược lý và công dụng a)
Tác dụng dược lý Năm 2002, Trần Công Luận và cộng sự đã khảo sát: Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với liều LD50 = 8,8 g/kg. Cao TTH có tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, đưa về trạng thái bình thường ở các liều thử nghiệm 44, 88, 176 mg/kg. Cao saponin toàn phần của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd ở nồng độ 25, 50, 100 μg/ml [11]. Nhóm nghiên cứu của Chun L. (2010) [26] đã thử tác dụng gây độc tế bào trên các dòng tế bào HL-60 (bệnh bạch cầu) và HCT-116 (ung thư ruột kết) của các hợp chất saponin từ 2 đến 12 (theo bảng 7), thấy rằng các chất đều có tác dụng gây độc tế bào ở mức độ khác nhau. Chất 11biểu hiện rõ ràng tác dụng gây độc tế bào HL-60 và HCT-116 với giá trị IC50 là 4,44 và 0,63 µM tương ứng; chất 5 có tác dụng gây độc tế bàotrung bình với giá trị IC50 là 41,45 và 6,50 µM. Sau khi các dòng tế bào HL-60 và HCT-116 được xử lý với các chất 11 và 5, thấy có sự chết tế bào theo chu trình. Chất 4, 8 có tác dụng gây độc tế bào với giá trị IC50 là 75,94 và 78,11 µM lên tế bào HCT-116. Các chất 3, 6, 9, 10, 12 đều có tác dụng gây độc tế bào với các giá trị IC50 lần lượt là 63,44; 67,08; 72,99; 76,23; 83,90; 91,16 µM lên dòng tế bào HL-60 và có tác dụng lên dòng HCT-116 với các giá trị IC50 lớn hơn 100 µM. Năm 2011, nhóm nghiên cứu tiếp tục thử tác dụng gây độc tế bào ung thư máu (HL-60) và ruột kết (HCT-116) của hai hợp chất polyacetylen là stipudiol và stipuol. Kết quả cho thấy cả 2 chất đều ức chế sự tăng sinh tế bào HL-60 và HCT- 116 với giá trị IC50 tương ứng là 0,13 và 0,28 μM ;0,5 và 0,8 μM [25]. Trong một công bố khác năm 2013, nhóm nghiên cứu của Chun L. chỉ ra rằng các saponin 2, 3, 4, 8, 9, 12 (theo bảng 7) có tác dụng ức chế NF-κB với giá trị IC50 từ 3,1 đến 18,9 μM. Ba hợp chất 3,4,9 ức chế hoạt động của NF-κBbằng cách giảm nồng độ của tác nhân gây viêm trên tế bào HepG2 [27]. b) Công dụng Tam thất hoang có tác dụng tán ứ, định thống. Sách đỏ Việt Nam (2007) ghi: “tất cả các bộ phận của cây đều có công dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục,

13 chống stress. Lá, nụ hoa dùng làm trà uống
có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần”[3]. Theo Đông y: tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng, tính ấm. Có tác dụng tư bổ cường tráng, tiêu viêm giảm đau, khử ứ sinh tân và cầm máu. Theo sách "Trung Quốc dược thực chí": tam thất hoang có tác dụng chữa thương tổn, cầm máu, có thể sử dụng để thay thế tam thất.Trên lâm sàng rễ củ tam thất hoang dược dùng để cầm máu các loại vết thương và xuất huyết. Cũng được dùng như tam thất làm thuốc bổ chữa thiếu máu, xanh xao gầy còm, nhất là đối với phụ nữ sau khi sinh đẻ, còn có tác dụng kích thích sinh dục và được dùng trong điều trị vô sinh. Liều dùng 4-8g thuốc bột hoặc rượu thuốc. Một số bài thuốc có tam thất hoang: - Chữa thống kinh (đau bụng trước kỳ kinh): Ngày uống 5 g bột TTH, uống 1 lần, chiêu với cháo loãng hoặc nước ấm. - Phòng và chữa đau thắt ngực: Ngày uống 3-6 g bột TTH (1 lần), chiêu với nước ấm. - Chữa thấp tim: Ngày uống 3 g bột TTH, chia 3 lần (cách nhau 6-8 giờ), chiêu với nước ấm. Dùng trong 30 ngày. - Chữa các vết bầm tím do ứ máu (kể cả ứ máu trong mắt): Ngày uống 3 lần bột TTH, mỗi lần từ 2-3 g, cách nhau 6-8 giờ, chiêu với nước ấm. - Chữa đau thắt lưng: Bột TTH và bột hồng nhân sâm lượng bằng nhau trộn đều, ngày uống 4 g, chia 2 lần (cách nhau 12 giờ), chiêu với nước ấm. Thuốc cũng có tác dụng bồi bổ sức khỏe cho người suy nhược thần kinh, phụ nữ sau sinh, người mới ốm dậy. 1.3. Tổng quan về tiêu chuẩn dược liệu Hiện tại, các nghiên cứu về tiêu chuẩn chất lượng của tam thất hoang còn rất hạn chế, chưa có tiêu chuẩn chất lượng cụ thể. Những quy định chung về tiêu chuẩn dược liệu[5]:  Mô tả: bao gồm những mô tả về hình thái, kích thước, màu sắc, mùi vị,cácđặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệuhoặc đặc điểm thể chất của dược liệu.

14  Định tính: là những phương pháp dùng để
nhận biết dược liệu bao gồmcáckinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa.  Nhận biết dược liệu dựa theo kinh nghiệm bằng phương pháp đơn giản và truyền thốngnhư sự chìm hay nổi trong nước, tiếng nổ, màu của ngọn lửa hay khói và mùi khi đốt cháy dược liệu…  Định tính dược liệu bằng phương pháp vi học, bao gồm: - Vi phẫu: Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu. Trong phần lớn các trường hợp, hình dạng và cấu trúc của vách tế bào có ý nghĩa quan trọng nhất trong khảo sát vi học. Vì vậy, khi quan sát các mẫu người ta thường loại bỏ tế bào chất, nhuộm màu màng tế bào để việc quan sát dễ dàng hơn. - Soi bột: mỗi một dược liệu đều có đặc điểm mô học đặc trưng, chúng được thể hiện một phần qua bột dược liệu. Khảo sát bột dược liệu bằng kính hiển vi để tìm ra những đặc điểm vi học đặc trưng của bột dược liệu, có vai trò trong việc địnhdanh, xác định độ tinh khiết, phân biệt dược liệu này với dược liệu dễ nhầm lẫn, phát hiện giả mạo nếu có và xây dựng tiêu chuẩn dược liệu.  Định tính lý học là việc xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực… của các dược liệu.  Định tính hóa học là phép thử một vài thành phần trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học. Phương pháp tiến hành được trình bày ở các chuyên luận dược liệu cụ thể.  Định tính sắc ký là việc sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao… để phát hiện một số thành phần có trong dược liệu; so sánh với chất chuẩn hay thành phần trong dược liệu chuẩn.  Định tính hu nh quang là quan sát sự phát hu nh quang của bề mặt hay mặt cắt dược liệu hoặc của dịch chiết dược liệu ở điều kiện thườnghay sau khi cho tác dụng với acid, kiềm hay thuốc thử. Trừ khi có quyđịnh riêng trong chuyên luận, mẫu thử được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách nguồn sáng khoảng 10 cm.  Định tính vi thăng hoa thường được tiến hành như sau: Đặt một vòng kim loại đường kính khoảng 2 cm, cao khoảng 8 mm lên một tấm kim loại mỏng có kích thước hơi lớn hơn. Trải một lớp mỏng bột dược liệu trong vòng kim loại và đậy kín

15 bằngmột phiến kính bên trên có đặt một miếng
bông tẩm nước lạnh. Đặt tấm kim loại đã có dược liệu này lên một lưới amiant có 1 lỗ tròn đường kính khoảng 2 cm sao cho vòng kim loại có dược liệu nằm trên lỗ này. Đun nóng nhẹ phía dưới lỗ cho đến khi bột dược liệu bị cháy xém. Nhấc phiến kính ra và để nguội. Quan sát hình dạng và màu sắc của tinh thể chất được thăng hoa đọng lại trên phiến kính bằng kính hiển vi và/hoặc tiến hành phản ứng hóa học thích hợp đối với chất đã được thăng hoa.  Thử tinh khiết: là cách kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu, có thể bao gồm một số hay tất cả các chỉ tiêu sau:  Mất khối lượng do làm khô.  Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric.  Các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối.  Tỉ lệ vụn nát của dược liệu.  Hàm lượng kim loại nặng.  Dư lượng các chất bảo vệ thực vật.  Xác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác).  Định lượng: là việc xác định hàm lượng một hay một số chất có trongdược liệu bằng phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học. Định lượngbao gồm cả việc xác định hàmlượng chất béo, tinh dầu và xác định hoạt lực bằng các phép thử sinh học.

16 CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và máy móc, thiết bị Mẫu tam thất hoang được thu hái tại Sa Pa, Lào Cai cóđộ tuổi 4-6 năm đã được xác định tên khoa học, được lưu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu với số hiệu: DL-020816 (Phụ lục 1) . Xử lý nguyên liệu: sau khi thu hái, nguyên liệu được rửa sạch, sấy khô ở 50ºC đến khi đạt độ ẩm dưới 10%. Sau đó được cắt miếng mỏng, xay nhỏ làm mẫu nghiên cứuvà được bảo quản trong túi kín. Hình 3. Nguyên liệu tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsaiet K.M. Feng) tươi Chất đối chiếu: stipuleanosid R1, stipuleanosid R2, acid oleanolic được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu Viện dược liệu. Dung môi hoá chất:methanol, ethanol, n-hexan,n-butanol, acid acetic băng, acid perchloric, vanillin,nước cất hai lần…dùng cho phân tích. Máy móc, thiết bị: máy siêu âm Power sonic 405; máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI); tủ sấy Memmert, Binder-FD115; bếp điện, bếp đun cách thủy; tủ sấy chân không Heraeus VT6025, Châu Âu; cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, cân xác định độ ẩm Precisa HA 60; máy đo quang Shimadzu UV-1800 UV-Vis Spectrophotometer.

17 2.2. Phương pháp nghiên cứu Xây dựng tiêu chuẩn
dược liệu Tam thất hoang dựa trên các chỉ tiêu chung được qui định tại phụ lục 12.2 DĐVN IV[5]gồm: Mô tả, soi bột, vi phẫu, độ ẩm dược liệu, tro toàn phần, định tính, định lượng,… 2.2.1. Mô tả Tiến hành trên mẫu dược liệu là thân rễ đã sấy khô. Kiểm tra hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan, kiểm tra kích thước bằng cách đo. 2.2.2. Vi phẫu Mẫu dược liệu TTH tươi cả 3 phần lá, thân, thân rễ được tiến hành cắt vi phẫu, tẩy sáng trong dung dịch javel, rồi nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh metylen. Lên tiêu bản, sử dụng kính hiển vi để soi các đặc điểm vi phẫu của dược liệu[17]. 2.2.3. Soi bột Phần thân rễ TTH được làm khô rồi nghiền thành bột, lên tiêu bản bằng một giọt dung dịch glycerin, quan sát các đặc điểm của bột bằng kính hiển vi[17]. 2.2.4. Độ ẩm Sử dụng cân xác định độ ẩm Precisa HA 60 (cân chính xác khoảng 1 g phần thân rễ đã cắt nhỏ, khởi động máy và đọc kết quả khi máy dừng). 2.2.5. Tro toàn phần Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.8. Mẫu nghiên cứu là bột phần thân rễ đã được sấy khô. Tỷ lệ % tro toàn phần của dược liệu được tính theo công thức: Trong đó:m: khối lượng tro (g); M: khối lượng mẫu thử (g); A: độ ẩm của mẫu thử (%). 2.2.6. Tro không tan trong acid Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.7.Mẫu nghiên cứu là bột phần thân rễ đã được sấy khô.

18 Tỷ lệ % tro không tan trong acid của
dược liệu được tính theo công thức: Trong đó:m: khối lượng tro (g); M: khối lượng mẫu thử (g); A: Độ ẩm của mẫu thử (%). 2.2.7. Định tính a) Dựa trên tính chất tạo bọt Lấy 1 g bột thân rễ, thêm 15 ml ethanol 70% (TT) đun trên cách thủy 10 phút, lọc. Lấykhoảng 1 ml dịchlọc pha loãng với nước cất thành 10 ml. Lắc mạnh 15 giây, có bọt bền[17]. b) Phương pháp sắc kí lớp mỏng (DĐVN IV, phụ lục 5.4) - Chuẩn bị mẫu: Dung dịch thử: Lấy 1g bột phần thân rễ, thêm 10 ml methanol, siêu âm 15 phút,lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký. Dung dịch đối chiếu: hòa tan 1 mg mỗi loại chất đối chiếu stipuleanosid R1 và stipuleanosid R2 trong 1 ml methanol. - Điều kiện sắc ký: Pha động: hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nước (4:5:1, lớp trên) với SKLM pha thường, aceton : nước (2:1) với SKLM pha đảo. Pha tĩnh: Silica gel 60F 254 (Merck) đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 105°C trong 60 phúttrước khi dùng. - Phương pháp phát hiện: Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol, ánh sáng tử ngoại UV 254 nm và UV 366 nm. - Cách tiến hành: Trên bản mỏng silica gel 60F 254 tráng sẵn (Merck), đã hoạt hóa ở 105°C trong 1 giờ, chấm riêng biệt 10 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu, tiến hành sắcký theo DĐVN IV, phụ lục 5.4. Sau khi triển khai hệ dung môi được khoảng 8 cm, lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi, phun thuốc thử. Sấy bản mỏng ở 105°C trong 5 phút. Quan sát bản mỏng dưới UV 254 nm, UV 366nm và ánh sáng thường.

19 2.2.8. Định lượng a) Định lượng theo phương pháp
cân Cân chính xác 10 g bột dược liệu phần thân rễđã rây qua rây số 335 (đã được đo độ ẩm) chiết Soxhlet với khoảng 100 ml n-hexan (TT) để loại chất béo (khoảng 8 giờ), lấy bã bay hết hơi n-hexan.Sau đó chiết bằng 100 ml methanol (TT). Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Hòa tan cắn trong 20 ml nước rồi lắc với n-butanol bão hòa nước (TT) đến khi lớp n-butanol nhạt màu. Gộp dịchn- butanol, rửa 3 lần bằng nước cất. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, hòa tan cắn bằng 2 ml ethanol 80% rồi chuyển vào một cốc đã được xác định khối lượng trước. Bốc hơi trên cách thủy được cắn. Sấy khô cắn ở 105ºC trong 3 giờ. Cân cắn[5]. Tính hàm lượng saponin tổng theo dược liệu khô kiệt theo công thức: Trong đó: X: hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu (%); Mc: là khối lượng cao thu được (g); Mt: là khối lượng mẫu thử (g); A: là hàm ẩm dược liệu (%). b) Định lượng theo phương pháp đo quang  Xây dựng phương pháp đo quang Căn cứ vào các tài liệu tham khảo [2,20,87,88]và quy trình thực nghiệm, chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng như sau:  Chuẩn bị thuốc thử, dung dịch chuẩn, dung dịch thử và môi trường - Chuẩn bịthuốc thử vanillin trong acid acetic băng 50mg/ml: Cân 0,5g vanillin tinh thể pha trong acid acetic băng vừa đủ 10ml thu được thuốc thử có nồng độ 50mg/ml. - Thuốc thử: acid perchloric - Môi trường: acid acetic băng - Dung dịch chuẩn: Lấy chính xác khoảng 5,0 mg chất chuẩn acid oleanolic pha trong ethanol tuyệt đối vừa đủ 50,0ml thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1mg/ml.

20 - Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 5,0
g bột phần thân rễ, chiết hồi lưu với ethanol 50% (tỉ lệ dung môi : dược liệu = 10 : 1) ở 70ºC trong 3 lần, mỗi lần 0,5 giờ. Lọc, gộp dịch chiết và loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn toàn phần. Cân chính xác khoảng 5,0 mg cắn pha trong ethanol tuyệt đối vừa đủ 10ml thu được dung dịch thử có nồng độ 0,5 mg/ml (nếu cắn không tan hết thì bổ sung thêm vài giọt nước và siêu âm).  Khảo sát và tìm điều kiện đo quang - Khảo sát cực đại hấp thụ quang Tiến hành quét phổ với 3 dung dịch: dung dịch chuẩn, dung dịch thử sau khi tiến hành phản ứng với thuốc thử acid perchloric và vanillin trong acid acetic băng và dung dịch thử không tiến hành phản ứng với các thuốc thử. Sau đó quét phổ trên máy đo quang phổ trong khoảng bước sóng từ 300 –800nm. Cuvet thạch anh có bề dày 1cm.Dung dịch so sánh là mẫu trắng được làm song song với mẫu thử, chỉ không chứa chất nghiên cứu. - Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng Nhiệt độcủa phản ứng được khảo sát bằng cách tiến hành phản ứng ởcác nhiệt độ khác nhau (điều chỉnh nhiệt độ bằng bể điều nhiệt). - Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng Thời gian của phản ứng được được khảo sát bằng cách tiến hành phản ứng trong các khoảng thời gian khác nhau tại nhiệt độ đã xác định. Phản ứng tạo màu được cho là ổn định khi giá trị độ hấp thụ của nó ít dao động. - Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin Nồng độ thuốc thử vanillin được khảo sát bằng cách tiến hành phản ứng với những lượng thuốc thử vanillin khác nhau trong cùng điều kiện phản ứng đã chọn. - Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric Nồng độthuốc thử acid perchloric được khảo sát bằng cách tiến hành phản ứng với những lượng thuốc thử acid perchloric khác nhau trong cùng điều kiện phản ứng đã chọn.  Thẩm định và đánh giá phương pháp  Xác định khoảng nồng độ tuyến tính

21 Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích
là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định, được biểu thị bằng phương trình y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R. Cách xác định: khảo sát trên 1 dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và mật độ quang bằng phương trình hồi quy tuyến tính.Yêu cầu đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan R ≥ 0,99 [1,20].  Độ lặp lại Độ lặp lại của một phương pháp pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất [20]. Độ lặp lại được biểu thị bằng RSD[1]. Tiến hành: Phân tích 1 mẫu 6 lần song song. Xác định kết quả định lượng tiến hành trong cùng điều kiện và tính RSD.  Độ đúng Là mức độ sát gần các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực. Để xác định độ đúng, thực hiện với một dung dịch mẫu đối chiếu acid oleanolic có nồng độ chính xác 10,0 µg/ml. Sau đó tiến hành phân tích mẫu lặp lại 6 lần.  Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Office Excel. Hàm lượng saponin (%) tính theo dược liệu khô được tính bằng công thức: Trong đó: C: nồng độ của acid oleanolic trong dung dịch mẫu thử (g/ml); k: hệ số pha loãng; A: hàm ẩm dược liệu (%); B: Hàm ẩm cao (%); mcao : khối lượng cao chiết được (g); mcân : khối lượng cao dùng định lượng (g); mdl : khối lượng dược liệu dùng định lượng (g).

22 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1.
Đặc điểm vi phẫu và bột 3.1.1. Đặc điểm vi phẫu a) Đặc điểm vi phẫu lá Quan sát trên tiêu bản vi phẫu lá (Hình 4)nhận thấy: Phần gân lá:Mặt trên và mặt dưới đều lồi. Biểu bì (1) gồm một lớp tế bào hình đa giác hoặc chữ nhật tương đối đều, mặt trên tế bào biểu bì hơi to hơn ở mặt dưới. Lớp cutin dày có răng cưa nhỏ. Mô dày phiến (2) gồm nhiều tế bào hình đa giác đều nhau, xếp thành 1-2 lớp tế bào ở cả hai mặt, mô dày góc (3) ở đỉnh lồi lên của mặt trên dưới mô dày phiến, tế bào hình đa giác không đều, xếp lộn xộn . Mô mềm(4) gồm các tế bào thành mỏng, hình đa giác, kích thước không đều, chiếm khoảngphần lớn vi phẫu. Trong mô mềm rải rác tế bàochứa tinh thể calci oxalate (7). Bó libe gỗ (5) nằm trong khối mô mềm, xếp thành từng vùng làm thành hình vòngcung, mặt lõm hướng lên trên. Trong bó libe gỗ, vòng gỗ (5)nằm trong, vòng libe (6) nằm ở ngoài. Phía trong và ngoài bó libe gỗ đều có ống tiết ly bào (8) tạo bởi 5-7 tế bào. Phần phiến lá:Tế bào biểu bì hình chữ nhật, biểu bì trên (9) to hơn biểu bì dưới (11). Mô mềm (10) gồm các tế bào nằm kích thước không đều, thành mỏng, uốn lượn, hình chữ nhật hoặc hình đa giác bên trong chứa nhiều lục lạp. Rải rác trong mô mềm có các bó gân phụ.

23 A. Gân lá: 1. Biểu bì, 2. Mô dày
phiến, 3. Mô dày góc, 4. Mô mềm, 5. Libe, 6. Gỗ, 7. Mô mềm chứa tinh thể calci oxalat, 8 . Ống tiết ly bào. B. Phiến lá: 9. Biểu bì trên, 10. Mô mềm, 11. Biểu bì dưới. Hình 4. Vi phẫu lá b) Đặc điểm vi phẫu thân Quan sát trên tiêu bản vi phẫu thân (Hình 5), nhận thấy: Phần thân trên cao có tiết diện đa giác nhiều cạnh, phần thân sát thân rễ tiết diện hình bầu dục. Thân từ ngoài vào trong thấy gồm các phần: ngoài cùng là biểu bì (1) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật hoặc đa giác xếp đều đặn, bên ngoài có phủ lớp cutin dày có răng cưa. Mô dày phiến (2) gồm nhiều tế bào hình đa giác không đều nhau, xếp thành 2-4 lớp. Mô mềm (3) gồm các tế bào hình trứng kích thước không đều nhau, tăng dần từ ngoài vào trong. Ở phần thân trên cao (A), mô mềm hóa gỗ (4) tạo thành một vòng nối các bó libe gỗ. Trên các bó libe gỗ, mô mềm hóa mô cứng (5) tạo thành dải phủ bên trên libe. Ở phần thân sát thân rễ (B) không có hiện tượng này, mô mềm có chứa rải rác tinh thể calci oxalat (10). Mô mềm chiếm hầu hết vi phẫu. Tiếp theo là bó libe gỗ tập trung thành từng vùng hình bầu dục xếp cách đều dưới mô dày, mạch gỗ (6) tạo thành tia hướng tâm nằm trong mô mềm gỗ không hóa gỗ, libe (7) tạo thành vòng bao quanh các mạch gỗ. Trong cùng là mô mềm ruột (8). Ngoài ra còn có các ống tiết ly bào (9) trong mô mềm , thường ở trong và ngoài bó libe gỗ. 9 10 11 5 3 1 2 4 7 6 8 A B

24 Hình 5. Vi phẫu thân A. Phần thân trên
cao; B. Phần thân sát thân rễ. 1. Biểu bì, 2. Mô dày, 3. Mô mềm vỏ, 4. Mô mềm hóa gỗ, 5. Mô mềm hóa mô cứng, 6. Libe, 7. Gỗ, 8. Mô mềm ruột, 9. Ống tiết ly bào, 10. Tinh thể calci oxalat trong mô mềm. c) Đặc điểmvi phẫu thân rễ Mặt cắt ngang thân rễ tam thất hoang có dạng hình bầu dục, cắt tiêu bản vi phẫu hình tam giác (Hình 6), từ ngoài vào trong gồm các phần: Bần (1) gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, vách mỏng uốn lượn xếp xuyên tâm, bong tróc rất nhiều. Mô mềm vỏ (2) nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước khác nhau, vách uốn lượn. Libe-gỗ hình thoi xếp đều đặn: Libe (4) là những tế bào hình tròn hoặc bầu dục vách dày mỏng xen kẽ nhau, xếp thẳng hàng. Mạch gỗ (6) tế bào đa giác tròn, kích thước không đều, phân bố đều trong vùng mô mềm gỗ; mô mềm gỗ là các tế bào đa giác, vách cellulose. Tầng phát sinh libe gỗ (5) nằm giữa libe và gỗ ở các bó và kéo dài nối liền giữa các bó. Tia ruột (7) rất rộng, nằm giữa các bó libe gỗ, gồm các tế bào hình chữ nhật. Tinh thể calci oxalatehình cầu gai rất nhiều đặc biệt ở tia ruột và mô mềm vỏ, mô mềm tủy. Mô mềm ruột (8) gồm rất nhiều tế bào hình đa giác nhiều cạnh, kích thước hơi to hơn các tế bào mô mềm vỏ. Rải rác ở mô mềm vỏ, nhất là ở libe và cả mô mềm ruột đều có các ống tiết ly bào (3) kích thước to nhỏ khác nhau.

25 Hình 6. Vi phẫu thân rễ 1. Bần, 2.
Mô mềm vỏ, 3. Ống tiết ly bào, 4. Libe, 5. Tầng phát sinh libe gỗ, 6. Gỗ, 7. Tia ruột và các tinh thể calci oxalat, 8. Mô mềm ruột. 3.1.2. Đặc điểm bột dược liệu a) Đặc điểm bột lá Bột lá có màu xanh lục đậm, mùi thơm, vị đắng. Quan sát dưới kính hiển vi (Hình 7) nhận thấy các đặc điểm: biểu bì mang lỗ khí (1), mạch xoắn (2), mảnh mô mềm (3), mảnh mang màu (4), biểu bì cuống lá (5). 1 4 2 5 6 3 7 8

26 Hình 7. Bột lá b) Đặc điểm bột thân
Bột có màu vàng nhạt, mùi thơm hắc. Quan sát dưới kính hiển vi (Hình 8), nhận thấy: các mảnh mạch (1): gồm mạch vạch (2), mạch mạng (3), mạch xoắn (4), mạch điểm (5); mảnh mô mềm (6) rải rác có tinh thể calci oaxalat hình cầu gai trong tế bào; bó sợi (7) và mảnh biểu bì (8); ngoài ra còn có mảnh mang màu (9). Hình 8. Bột thân 9

27 c) Đặc điểm bột thân rễ Bột có màu
vàng nhạt, mùi thơm hắc, vị ngọt hơi đắng. Quan sát dưới kính hiển vi (Hình 9), nhận thấy: Mảnh bần (1). Mảnh mô mềm mang tinh thể calci oxalat (2). Các mảnh mạch: mạch mạng (3), mạch vạch (4). Hạt tinh bột đứng đơn lẻ (5) và tập trung thành đám (6), hình tròn có rốn rõ, kích thước 3-5 µm. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai (7), kích thước 20-25 μm. Các mảnh mang màu (8) có kích thước khác nhau,khoảng 15-25 µm. Hình 9. Bột thân rễ 3.2. Độ ẩm Dùng phương pháp xác định hàm ẩm bằng sử dụng cân hồng ngoại, kết quả thu được như bảng 8. Bảng 8. Độ ẩm của dược liệu tam thất hoang STT Hàm ẩm (%) Giá trị trung bình (%) 1 6,85 6,68 ± 0,17 2 6,40 3 6,80 4 6,58 Nhận xét: độ ẩm các mẫu dược liệu TTH trung bình khoảng 6,7%. Tuy nhiên, trong quá trình thực nghiệm khi độ ẩm dược liệu khoảng 10% dược liệu vẫn

28 được bảo quản tốt, không bị hỏng hay ẩm
mốc, mối mọt. Do vậy qui định hàm ẩm dược liệu không quá 10%. So với tiêu chuẩn về độ ẩm của các dược liệu khác trong DĐVN IV [5]: Nhân sâm (không quá 12,0%), đẳng sâm Việt Nam (không quá 15%), sâm Việt Nam (không quá 13%), tam thất (không quá 13%) thì độ ẩm của TTH là khá thấp. Do đó việc bảo quản dược liệu TTH sẽ khó khăn hơn so với các loài Sâm khác. 3.3. Tro toàn phần Tiến hành theo phương pháp 2 (Phụ lục 9.8 DĐVN IV). Kết quả thu được như sau: Bảng 9. Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu tam thất hoang Khối lượng dược liệu (g) Hàm ẩm (%) Khối lượng tro (g) Tỷ lệ tro toàn phần (%) Lần 1 1,1354 6,68 0,0906 8,55 Lần 2 1,0587 6,68 0,0822 8,32 Lần 3 1,0967 6,68 0,0858 8,38 Trung bình 8,42 ± 0,10 Từ bảng trên cho thấy tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu TTH trung bình là 8,42%, mẫu cao nhất là trên 8,5%. Do vậy, qui định tỷ lệ tro toàn phần dược liệu không quá 9%. Kết quả này tương đương với tỷ lệ tro toàn phần của một số dược liệu như: sâm Việt Nam (không quá 10%), đan sâm (không quá 10%)[5]. 3.4. Tro không tan trong acid Tiến hành theo phương pháp 1 (Phụ lục 9.7 DĐVN IV), kết quả thu được như bảng sau: Bảng 10. Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu tam thất hoang Khối lượng dược liệu (g) Hàm ẩm (%) Khối lượng tro (g) Tỷ lệ tro không tan trong acid (%) Lần 1 1,1354 6,68 0,0175 1,65 Lần 2 1,0587 6,68 0,0104 1,05 Lần 3 1,0969 6,68 0,0136 1,33 Trung bình 1,34 ± 0,24

29 Nhận xét: tỷ lệ tro không tan trong acid
của dược liệu TTH cao nhất là trên 1,6%. Vậy tiêu chuẩn cơ sở quy định tỷ lệ tro không tan trong acid không quá 2%. So với các dược liệu thuộc nhóm “Sâm” trong chuyên luận DĐVN IV[5] như: đẳng sâm Việt Nam (không quá 2,0%), đẳng sâm Việt Nam chế (không quá 2,0%), nhân sâm (không quá 1,0%), tỷ lệ tro không tan trong acid của TTH không có sự khác biệt nhiều. 3.5. Định tính a) Phản ứng tạo bọt Sau khi tiến hành phản ứng tạo bọt như mục 2.2.7, sau 15 phút trong ống nghiệm có cột bọt bền, sơ bộ kết luận dược liệu tam thất hoang có saponin. b) Sắc ký lớp mỏng Tiến hành chạy SKLM với bản mỏng pha thường và pha đảo, hệ dung môi và chất thử, chất đối chiếu được chuẩn bị như mục 2.2.7 . Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử có chứa các vết có Rf và màu sắc tương tự như dung dịch chuẩn. Sắc ký đồ pha thường A. Phun thuốc thử, ánh sáng thường; B. Phun thuốc thử, UV256 ; C. Phun thuốc thử, UV365. Sắc ký đồ pha đảo A. Phun thuốc thử, ánh sáng thường; B. Phun thuốc thử, UV365 . Hình 10. Sắc ký đồ của dịch chiết tam thất hoang (B) và chất chuẩn stipuleanosid R1(06) và stipuleanosid R2 (05). A B 05 06 B 05 06 B 05 06 B

30 3.6. Định lượng 3.6.1. Định lượng theo phương pháp
cân Kết quả thu được trình bày trong bảng sau: Bảng 11. Hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu tam thất hoang Khối lượng dược liệu (g) Khối lượng cắn (g) Hàm ẩm dược liệu (%) Hàm lượng saponin tổng (%) Mẫu 1 10,0066 0,3006 6,68 3,22 Mẫu 2 10,1392 0,3026 6,68 3,20 Mẫu 3 10,0704 0,3022 6,68 3,22 Trung bình 3,21 ± 0,01 Từ bảng kết quả trên đưa ra tiêu chuẩn cơ sở quy định hàm lượng saponin tổng trong dược liệu tam thất hoang theo phương pháp cân không dưới 3%. Nhận xét: Kết quả định lượng saponin tổng trong THH bằng phương pháp cân tương đương với hàm lượng saponin tổng trong đảng sâm Việt Nam (không dưới 3,0%) khi sử dụng cùng phương pháp định lượng [5]. 3.6.2. Định lượng theo phương pháp đo quang a) Khảo sát cực đại hấp thụ quang - Hút chính xác 2 ml dung dịch chuẩn (bình 1), 2 ml dung dịch thử (bình 2,3)(được chuẩn bị như trên) vào bình định mức 10 ml, bốc hơi trên bếp cách thủy ở 80ºC đến cắn. Thêm 0,3ml vanillin/acid acetic băng (TT) và 1ml acid perchloric (TT) vào bình 1, bình 2, lắc đều và ủ cả 3 bình ở 70ºC trong 10 phút. Sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá và thêm dung dịch acid acetic băng đến vạch. - Dung dịch so sánh là mẫu trắng được chuẩn bị song song với dung dịch chuẩn, chỉ không chứa chất chuẩn phân tích. - Quét phổ trên máy đo quang phổ trong khoảng bước sóng từ 300 – 800nm. Kết quả thu được như hình:

31 Hình 11. Phổ hấp thụ của các dung dịchtrong
khoảng bước sóng từ 300 – 800nm Chú thích: 1. Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn acid oleanolic; 2. Phổ hấp thụ của dung dịch thử sau phản ứng với thuốc thử; 3. Phổ hấp thụ của dung dịch thử không có phản ứng với thuốc thử. Từ kết quả trên cho thấy, độ hấp thụ quang của dung dịch đạt giá trị cực đại tại bước sóng 548nm - 550nm. Do đó chúng tôi chọn 550nm là bước sóng khảo sát. b) Khảo sát điều kiện phản ứng Nhằm xác định các điều kiện tối ưu cho phản ứng tạo màu với thuốc thử, chúng tôi khảo sát các yếu tố của phản ứng sau:  Khảo sát nhiệt độ phản ứng Chuẩn bị 6 bình định mức dung tích 10ml, đánh số từ 1-6. Hút chính xác vào 5 bình mỗi bình 1,5ml dung dịch chuẩn, làm khô đến cắn. Thêm vào cả 6 bình 0,3ml thuốc thử vanillin và 1ml thuốc thử acid perchloric, đặt bình vào bể điều nhiệt với các nhiệt độ tương ứng (50ºC, 60ºC, 70ºC, 80ºC, 90ºC) trong 10 phút, sau đó làm lạnh nhanh, thêm acid acetic băng đến vạch và đo quang tại bước sóng 550nm, bình 6 là mẫu trắng. Kết quả được trình bày trong bảng 12.

32 Bảng 12. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
tới mật độ quang Nhiệt độ (ºC) 50 60 70 80 90 Mật độ quang (abs) 0,349 0,444 0,662 0,716 0,729 Hình 12. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới mật độ quang Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy, ở nhiệt độ 70-90ºC mật độ hấp thụ quang đạt cực đại và không thay đổi nhiều. Vì thế ở các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành phản ứng ở nhiệt độ 70ºC .  Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng Chuẩn bị 8 bình định mức dung tích 10ml, đánh số từ 1-8. Hút chính xác vào 7 bình (từ 1-7) mỗi bình 1,5ml dung dịch chuẩn, làm khô đến cắn. Thêm vào cả 7 bình 0,3ml thuốc thử vanillin và 1ml thuốc thửacid perchloric, lắc đều. Cho vào bểđiều nhiệt ở70ºC trong những khoảng thời gian nhất định (5 phút, 10 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút, 35 phút), sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá, thêm acid acetic băng đến vạch, lắc đều và đo độ hấp thụ tại 550nm. Bình 8 là mẫu trắng. Kết quả khảo sát thu được như bảng 13. Bảng 13. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới mật độ quang Thời gian (OC) 5 10 15 20 25 30 35 Mật độ quang (abs) 0,352 0,426 0,594 0,673 0,673 0,65 0,615 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 40 50 60 70 80 90 100 nhiệt độ (ºC) mật độ quang (abs)

33 Hình 13. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian
phản ứng tới mật độ quang Nhận xét: Kết quả trên cho thấy sau 20 phút phản ứng, độ hấp thụ đạt cực đại và gần như không thay đổi khi tăng thời gian. Vì thế ở các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành phản ứng trong thời gian 20 phút.  Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin/acid acetic băng Tiến hành:Chuẩn bị 6 bình định mức dung tích 10ml, đánh số từ 1-6. Hút chính xác vào 5 bình (từ 1-5), mỗi bình 1,5ml dung dịch chuẩn, làm khô đến cắn.Thêm vào cả 6 bình lượng thuốc thử vanillin tương ứng như trong bảng và 1ml thuốc thử acid perchloric, lắc đều. Cho các bình vào bể điều nhiệt ở nhiệt độ 70ºC trong 20 phút, sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá, thêm acid acetic đến vạch, lắc đều và đem đo độ hấp thụ ở 550 nm. Bình 6 là mẫu trắng. Kết quả thu được như bảng 14: Bảng 14. Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin Thể tíchvanillin (TT) (ml) 0,1 0,3 0,6 0,9 1,2 Nồng độ vanillin (TT) (mg/ml) 0,5 1,5 3 4,5 6 Mật độ quang (abs) 0,366 0,545 0,708 0,692 0,679 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Thời gian (phút) Mật độ quang (abs)

34 Hình 14. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ
thuốc thử vanillin Nhận xét: Kết quả trên cho thấy khi dùng 0,6ml thuốc thử vanillin/acid acetic băng (tương ứng với nồng độ thuốc thử là 3mg/ml) thì mật độ quang đạt giá trị cực đại. Do đó trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi chọn giá trị này để khảo sát.  Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloric Chuẩn bị7 bình định mức dung tích 10ml, đánh số từ 1-7. Hút chính xác vào 6 bình (từ 1-6), mỗi bình 1,5ml dung dịch chuẩn, làm khô đến cắn.Thêm vào cả 6 bình 0,6ml thuốc thử vanillin và 1 lượng thuốc thử acid perchloric tương ứng như trong bảng, lắc đều. Cho các bình vào bể điều nhiệt ởnhiệt độ 70ºC trong 20 phút, sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá, thêm acid acetic đến vạch, lắc đều và đem đo độ hấp thụ ở 550nm. Bình 7 là mẫu trắng. Bảng 15. Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloeric Thể tích thuốc thử (ml) 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4 Nồng độ thuốc thử (g/ml) 0,424 0,848 1,526 1,696 2,12 2,544 Nồng độ thuốc thử (ml/ml) 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 0,24 Mật độ quang (abs) 0,33 0,522 0,605 0,625 0,634 0,613 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ thuốc thử vanillin (mg/ml) Mật độ quang (abs)

35 Hình 15. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ
thuốc thử acid perchloric Nhận xét: Khi thể tích acid perchloric từ 1,2ml đến 2,4ml thì mật độ quang đạt giá trị cực đại và không có sự thay đổi nhiều. Do đó, chúng tôi chọn thể tích acid perchloric là 1,2ml (tương ứng nồng độ1,526g/ml hay 0,12ml/ml) để khảo sát. Kết luận: Từ kết quả quá trình khảo sát chúng tôi đưa ra điều kiện định lượng như sau: - Nhiệt độ phản ứng: 70ºC . - Thời gian phản ứng: 20 phút. - Bước sóng đo quang: 550 nm. - Nồng độ thuốc thử vanillin/ acid acetic băng : 0,6 ml (3mg/ml). - Nồng độ thuốc thử acid perchloric: 1,2 ml (1,526 g/ml). c) Thẩm định phương pháp  Xác định khoảng tuyến tính Chuẩn bị các bình định mức dung tích 10 ml được đánh số thứ tự. Hút chính xác vào 6 bình định mức các thể tích dung dịch chuẩn lần lượt là 0,4ml, 0,8ml, 1,2ml, 1,6ml, 2ml, 2,4ml bốc hơi trênbếp cách thủy ở80ºC đến cắn. Lần lượt cho vào cả các bình này 0,6 ml thuốc thử vanillin/acid acetic băng, 1,2 ml thuốc thử acid perchloric rồi ủ ở 70ºC trong 20 phút. Sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá và thêm dung dịch acid acetic băng đến vạch. Lắc đều, đo độ hấp thụ quang tại 550nm. Mẫu trắng được chuẩn bị song song, chỉ không chứa chất chuẩn.Kết quả được trình bày ở bảng 16. Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở hình 16. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 0.24 0.28 Nồng độ thuốc thử acid perchloric (ml/ml) Mật độ quang (abs)

36 Bảng 16. Độ hấp thụ quang của dãy dung
dịch chuẩn Khối lượng acid oleanolic (mg) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Thể tích acid oleanolic (ml) 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4 Nồng độ chất chuẩn (µg/ml) 4 8 12 16 20 24 Mật độ quang (abs) 0,201 0,393 0,564 0,81 0,968 1,202 Phương trình hồi qui tuyến tính y = 0,0498x – 0,0079 Hệ số tương quan R2 = 0,9974 Hình 16. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ chất chuẩn tại bước sóng 550 nm Từ kết quả ở bảng 14 và hình 13 cho thấy với nồng độ của acid oleanolictrong dung dịch đo quang từ 4-24 µg/ml có sự tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ quang và nồng độ acid oleanolic theo phương trình y = 0,0498x – 0,0079với hệ số tương quan R2 = 0,9974.  Khảo sát độ lặp lại của phương pháp Để xác định độ lặp lại của phương pháp, tiến hành với 6 thí nghiệm riêng biệt, với cùng điều kiện chiết. Tiến hành: chuẩn bị bình định mức dung tích 10 ml. Hút chính xác vào bình định mức 1 ml dung dịch thử,bốc hơi trên cách thủy ở 80ºC đến cắn. Lần lượt cho vào bình này 0,6 ml thuốc thử vanillin/acid acetic băng, 1,2 ml thuốc thử acid perchloric rồi ủ ở 70ºC trong 20 phút. Sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá và thêm dung dịch acid acetic băng đến vạch. Lắc đều, đo độ hấp thụ quang tại 550nm. y = 0.0498x - 0.0079 R² = 0.9974 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 5 10 15 20 25 30 Mật độ quang (abs) Nồng độ acid oleanolic (μg/ml)

37 Mẫu trắng được chuẩn bị song song, chỉ không
chứa dung dịch thử. Kết quả thu được như sau: Bảng 17. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đo quang Mẫu Khối lượng dược liệu (g) Hàm ẩm dược liệu (%) Khối lượng cắn (g) Hàm ẩm cắn (%) Khối lượng cân (g) Mật độ quang (abs) Mật độ quang trung bình (abs) Hàm lượng saponin trung bình (%) m1 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0055 0,538 0,539 7,767 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0055 0,540 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0055 0,539 m2 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0051 0,514 0,514 7,998 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0051 0,515 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0051 0,514 m3 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0057 0,558 0,558 7,750 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0057 0,558 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0057 0,557 m4 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0054 0,531 0,532 7,805 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0054 0,534 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0054 0,530 m5 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0057 0,557 0,558 7,759 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0057 0,560 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0057 0,558 m6 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0055 0,535 0,544 7,843 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0055 0,560 5,005 6,68 1,872 2,97 0,0055 0,538 RSD (%) = 1,094 Kết quả ở bảng cho thấy phương pháp có độ lặp lại có thể chấp nhận được thông qua RSD = 1,094 %.  Khảo sát độ đúng của phương pháp. Để xác định độ đúng, thực hiện đo quang với một dung dịch mẫu đối chiếu acid oleanolic có nồng độ chính xác 10,2 µg/ml ở các điều kiện đã khảo sát. Sau đó tiến hành phân tích mẫu lặp lại 6 lần. Kết quả được trình bày ở bảng 18.

38 Bảng 18. Kết quả xác định độ đúng của
phương pháp STT 1 2 3 4 5 6 Mật độ quang (abs) 0,525 0,515 0,518 0,512 0,529 0,537 Nồng độ acid oleanolic (µg/ml) 10,694 10,494 10,554 10,433 10,775 10,935 Ctrung bình = 10,648; SD = 0,173; t = 2,005 Tra bảng thấy, ở mức độ tin cậy 95%, bậc tự do K = 6+6-2 thì t (0,95; 10) = 2,228. Như vậy: t = 2,005< t (0,95; 10) không có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung bình so với giá trị tham chiếu ở mức ý nghĩa 5%, tức là phương pháp có độ đúng đạt yêu cầu. d) Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng vào định lượng một số mẫu TTH Cách tiến hành: chiết dược liệu bằng phương pháp chiết hồi lưu, sử dụng ethanol 50% và pha dung dịch thử như trình bày ở mục 2.2.8. Tiến hành: Hút chính xác 1 ml dung dịch thử vào bình định mức 10 ml, bốc hơi trên cách thủy ở 80ºC đến cắn. Thêm 0,6 ml vanillin/acid acetic băng và 1,2 ml acid perchloric vào bình, lắc đều và ủ ở 70ºC trong 20 phút. Sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá và thêm dung dịch acid acetic băng đến vạch. Dung dịch so sánh là mẫu trắng được chuẩn bị song song với dung dịch thử. Định lượng theo phương pháp đường chuẩn.Kết quả thu được trình bày trong bảng sau: Bảng 19. Kết quả định lượng saponin tổng trong một số mẫu tam thất hoang Mẫu Khối lượng dược liệu (g) Hàm ẩm dược liệu (%) Khối lượng cắn (g) Hàm ẩm cắn (%) Khối lượng cân (g) Mật độ quang (abs) Hàm lượng saponin tổng (%) m1 5,007 6,68 1,875 2,97 0,0046 0,48 8,29 m2 5,008 6,68 2,076 2,97 0,0055 0,531 8,48 m3 5,007 6,68 2,07 2,97 0,0056 0,558 8,72 m4 5,002 6,68 2,259 2,97 0,0054 0,563 8,17 m5 5,047 6,68 2,051 2,97 0,0057 0,557 8,41 m6 5,007 6,68 1,89 2,97 0,0053 0,538 8,12 Trung bình 8,37 ± 0,20

39 Từ bảng kết quả trên đưa ra tiêu chuẩn
cơ sở quy định hàm lượng saponin tổng trong dược liệu tam thất hoang theo phương pháp đo quang không dưới 8,0 %. Nhận xét: So với tiêu chuẩn cơ sở của sâm Việt Nam, hàm lượng saponin tổng trong TTH là tương đương(tiêu chuẩn hàm lượng saponin toàn phần của sâm Việt Nam khi định lượng bằng phương pháp đo quang không ít hơn 9% quy theo chuẩn Ginsenosid Rg1) [5]. 3.7. Bàn luận Về mô tả dươc liệu: TTH chưa có chuyên luận riêng của các dược điển các nước để đối chiếu, do đó chúng tôi mô tả dược liệu đã được giám định tên khoa học. Tuy nhiên, nghiên cứu này mới thực hiện trên mẫu thu hái tại Sa Pa-Lào Cai năm 2016. Kết quả sẽ tốt hơn nếu thực hiện quan sát trên nhiều mẫu thực hiện thu hái ở một số vùng khác nhau. Về khảo sát các chỉ tiêu theo các tiêu chí quy định trong dược điển Việt Nam: khi xây dựng tiêu chuẩn cho một dược liệu nhóm nghiên cứu đã đánh giá các chỉ tiêu về độ ẩm, tỷ lệ tro toàn phần, tỷ lệ tro không tan trong acid là những chỉ số đặc trưng giúp đánh giá chất lượng của dược liệu TTH trước khi đưa vào sử dụng. Do thời gian và kinh phí không cho phép nên một số chỉ tiêu chưa thực hiện được như các tạp chất lẫn trong dược liệu, tỷ lệ vụn nát dược liệu, hàm lượng kim loại nặng, hàm lượng các chất có thể chiết đượctrong dược liệu bằng dung môi (nước, ethanol,…). Về định tính: chúng tôi đã sử dụng cả phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa. Phương pháp vi học được nghiên cứulần đầu tiên ở dược liệu này, có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định đúng dược liệu TTH. Phương pháp lý hóa: thử tính chất tạo bọt của saponin và SKLM giúp phát hiện thành phần saponin trong dược liệu. Nghiên cứu đã đề xuất được hệ dung môi phù hợp để định tính thành phần 2 chất chính trong dược liệu tam thất hoang bằng phương pháp SKLM. Về định lượng:chúng tôi đã xác định đượchàm lượng saponin tổng trong dược liệu TTH bằng phương pháp cân và phương pháp đo quang. Đối vớixây dựng phương pháp đo quang: Do các saponin ít có các nối đôi, nhất là nối đôi liên hợp nên chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng sóng ngắn 195-210 nm. Vì vậy,đểđịnh lượng được saponin bằng phương pháp đo quang, chúng tôi tiến hành phản ứng Rosenthaler của saponin với thuốc thử acid perchloric và vanillin trong acid acetic băng cho sản phẩm màu tím hoa cà. Các nghiên cứu về thành phần hóa

40 học của TTH đã chỉ ra rằng phần thân
rễ TTH chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao, do đó chúng tôi chọn acid oleanolic làm chất chuẩn trong định lượng saponin tổng bằng phương pháp đo quang.Dựa trên các tài liệu tham khảo, chúng tôi đã tiến hành khảo sát cực đại hấp thụ và các điều kiện làm phản ứng đo quang như ở mục 3.6.2.Quy trình đề xuất trong đề tài này có ưu điểm là đơn giản, dụng cụ, hóa chất rẻ tiền, an toàn vàcó thể áp dụng cho cả các mẫu có hàm lượng saponin thấp. Đồng thời dễ áp dụng trong các phòng thí nghiệm phân tích tiêu chuẩn. Tuy nhiên, quá trình thao tác thí nghiệm đòi hỏi điều kiện phản ứng chính xác về thời gian và nhiệt độ để tránh mắc sai số lớn. Mặt khác,quá trình tiến hành phản ứng đo quang diễn ra ở các nhiệt độ thay đổi (ủ ở 70ºC sau đó làm lạnh trong nước đá để dừng phản ứng và tránh bay hơi dung môi) nên kết quả đo quang khó ổn định. Thí nghiệm yêu cầu hóa chất có độ tinh khiết cao.

41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đề
tài đã phân tích được đặc điểm vi học của TTH bao gồm vi phẫu và soi bột với các đặc điểm đặc trưng. - Lần đầu tiên khảo sát, xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng saponin tổng bằng phương pháp đo quang tính theo acid oleanolic. - Đây là nghiên cứu bước đầu góp phần từng bước hoàn thiện chuyên luận tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu TTH của DĐVN trong tương lai. Trên cơ sở kết quả đạt được, nhóm nghiên cứu đề xuất dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu tam thất hoang (phụ lục II).Trong đó, độ ẩm:không quá 10,0%; tro toàn phần:không quá 9,0%; tro không tan trong acid: không quá 2,0%; định lượng: saponin tổng theo phương pháp cân không thấp hơn 3,0% tính theo dược liệu khô kiệt và theo phương pháp đo quang tính theo acid oleanolic không thấp hơn 8,0% tính theo dược liệu khô kiệt. Kiến nghị - Do thời gian có hạn, đề tàimới chỉ xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở với một mẫu trồng tại Lào Cai. Do đó, cần tiến hành nghiên cứu trên cỡmẫu nhiều hơn để việc kết luận các chỉ tiêu mới có thể mang tính đại diện cho dược liệu TTH. - Đề xuất xây dựng chỉ tiêu định lượng thành phần chính, đặc trưng của dược liệu TTH bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao góp phần kiểm soát tốt hơn chất lượng TTH và sản phẩm liên quan đến dược liệu này trong tương lai. - Đề xuất xác định tỉ lệ tạp chất trong dược liệu, tỉ lệ vụn nát và xác định hàm lượng kim loại nặng cho dược liệu TTH. - Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu tam thất hoang để bổ sung một chuyên luận mới về dược liệu TTH trong Dược điển Việt Nam.

42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Trần Tử
An (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội, tr. 20-21. 2. Trần Tử An và Thái Nguyễn Hùng Thu ( 2006), Hoá phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.46-47. 3. Võ Văn Chi (2012), Từ điển Cây thuốc Việt Nam, Hà Nội, tr.770. 4. Nguyễn Thượng Dong (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật. 5. Dược điển Việt Nam (2010), Tập IV. 6. Trần Thanh Hà và các cộng sự (2015), "thành phần hóa học cặn chiết ethyl acetat sâm vũ diệp", Tạp chí Dược liệu. 2, tr. 86. 7. Nguyễn Thị Thu Hương và Bùi Thị Kim Cúc (2006), Nghiên cứu phát triển dược liệu và Đông dược ở Việt Nam, Tác dụng bảo vệ gan của sâm Việt Nam trong tổn thương gan thực nghiệm bằng ethanol, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr.288-295. 8. Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích và Đoàn Thị Ngọc Hạnh (2005), "Nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam và đinh lăng trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu. 10(6), tr. 196-200. 9. Nguyễn Thị Thu Hương và Trần Mỹ Tiên (2001), "Nghiên cứu tác dụng chống stress và chống trầm cảm của sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv. Araliaceae) và hoạt chất chính majonosid-R2", Tạp chí Dược liệu. 6(1), tr. 25- 27. 10. Nguyễn Thị Thu Hương và và cộng sự (2001), Công trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch của sâm Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr.464-466. 11. Trần Công Luận (2002), Phân tích thành phần hóa học và tác dụng dược lý từ thân rễ và rễ củ của hai loài sâm Panax bipinnatifidus Seem. và Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng. 12. Trần Công Luận (2003), "Kết quả nghiên cứu về hóa học sâm Việt Nam", Hội thảo bảo tồn và phát triển sâm Ngọc Linh tại tỉnh Quảng Nam, tr. 62-75. 13. Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên và Nguyễn Tập (2009), " Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất

43 hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng)", Tạp chí Dược
liệu. 14(1), tr. 17-23. 14. Lã Đình Mỡi và các cộng sự (2013), "Họ nhân sâm(Araliaceae Juss.)-nguồn hoạt chất sinh học đa dạng và đầy triển vọng ở Việt Nam", Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5, tr. 1152-1158. 15. Nguyễn Tập (2006), "Danh mục đỏ cây thuốc Việt Nam", Tạp chí Dược liệu. 11(3), tr. 97-105. 16. Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền và Lê Thanh Sơn (2006), "Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam", Tạp chí dược liệu. tập 5, tr. 177-180. 17. Nguyễn Viết Thân (2010), Thực tập dược liệu, Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội. 18. Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động để nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu. 11(5), tr. 202-206. 19. Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2005), "Nghiên cứu một số tác dụng dược lý của lá sâm Việt Nam - Tác dụng chống stress và tác dụng chống oxy hóa", Tạp chí Dược liệu. 10(1), tr. 27-32. 20. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010 ), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học và sinh học, NXB Khoa học và Kỹ Thuật. Tiếng Anh 21. Mucalo I. and et al (2012), "Effect of American ginseng (Panax quinquefoliusL.) on glycemic control in type 2 diabetes", Coll Antropol. 36(4), pp. 1435-40. 22. Bing Hui L. and et al (2010), "Antioxidants potentiate American ginseng- induced killing of colorectal cancer cells", Cancer Letters. 289(1), pp. 62-70. 23. Chang Hwa J. and et al (2005), "Effects of wild ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) leaves on lipid peroxidation levels and antioxidant enzyme activities in streptozotocin diabetic rats", Journal of Ethnopharmacology. 98(3), pp. 245- 250. 24. Chih Fu L. and et al (2003), "Protection by hot water extract of Panax notoginseng on chronic ethanol-induced hepatotoxicity", Phytotherapy Research. 17(9), pp. 1119–1122.

44 25. Chun L. and et al (2011), "Polyacetylenes from
Panax stipuleanatus and their cytotoxic effects on human cancer cells", Bull. Korean Chem. Soc. 32, pp. 3513-3518. 26. Chun L. and et al (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20(23), pp. 7110-7115. 27. Chun L. and et al (2013), "Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-κB", Journal of Ginseng Research. 37(1), pp. 74-79. 28. David L. Z. and David D. K. (2002), "Peripheral blood mononuclear cell production of TNF- in response to North American ginseng stimulation", Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 80(10), pp. 1030-1033. 29. Enrico De A. and et al (2007), "Study of the efficacy of Korean Red Ginseng in the treatment of erectile dysfunction", Asian Journal of Andrology. 9(2), pp. 241-244. 30. Eun Ah B., Ji Eun Shin and Dong Hyun Kim (2005), "Metabolism of ginsenoside Re by human intestinal microflora and its estrogenic effect", Biological and Pharmaceutical Bulletin. 28(10), pp. 1903-1908. 31. Fahim M. S. and et al (1982), "Effect of Panax ginseng on testosterone level and prostate in male rats", Journal of Reproductive Systems. 8(4), pp. 261-263. 32. Feng Q., Yi Ping Ye and Hong Xiang Sun (2006), "Haemolytic activity and adjuvant effect of notoginsenoside K from the roots of Panax notoginseng", Chemistry & Biodiversity. 3(10), pp. 1144–1152. 33. Fujimoto Y. and et al (1994), "Polyacetylenes from Panax quinquefolium", Phytochemistry. 35(5), pp. 1255-1257. 34. Fukuyama N., Shibuya M. and Orihara Y. (2012), "Antimicrobial polyacetylenes from Panax ginseng hairy root culture", Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 60(3), pp. 377-380. 35. Hae Ung L. and et al (2005), "Hepatoprotective effect of 20(S)-ginsenosides Rg3 and its metabolite 20(S)-ginsenoside Rh2 on tert-butyl hydroperoxide- induced liver injury", Biological and Pharmaceutical Bulletin. 28(10), pp. 1992-1994. 36. Hae Ung L. and et al (2005), "Hepatoprotective effect of ginsenoside Rb1 and compound K on tert-butyl hydroperoxide-induced liver injury", Liver International. 25(5), pp. 1069-1073.

45 37. Hasegawa H. and et al (1994), "Inhibitory effect
of some triterpenoid saponins on glucose transport in tumor cells and its application to in vitro cytotoxic and antiviral activities", Planta Medica. 60(3), pp. 240-243. 38. Hirakura K. and et al (1991), "Polyacetylenes from the roots of Panax ginseng", Phytochemistry. 30(10), pp. 3327-3333. 39. Hiroshi W. and et al (1991), "Effect of Panax ginseng on age-related changes in the spontaneous motor activity and dopaminergic nervous system in the rat", The Japanese Journal of Pharmacology. 55(1), pp. 51-56. 40. Hyo Jin A. and et al (2006), "The effect of Panax ginseng on forced immobility time & immune function in mice", Indian Journal of Medical Research. 124(2), pp. 199-206. 41. Jian Hua S., Song Hua H. and Xiao Ming S. (2007), "Adjuvant effects of protopanaxadiol and protopanaxatriol saponins from ginseng roots on the immune responses to ovalbumin in mice", Vaccine. 25(6), pp. 1114-1120. 42. Jian Bo W. and et al (2006), "Simultaneous determination of 11 saponins in Panax notoginseng using HPLC-ELSD and pressurized liquid extraction", Journal of Separation Science. 29(14), pp. 2190–2196. 43. Jiang K. Y. and Qian Z. N. (1995), "Effects of Panax notoginseng saponins on posthypoxic cell damage of neurons in vitro", Acta Pharmacologica Sinica. 16(5), pp. 399-402. 44. Jing Tian X., Sangeeta M. and Chun Su Y. (2005), "Ginseng and diabetes", Am. J. Chin. Med. 33(3), pp. 397-404. 45. Kazuo Y. (2000), "Bioactive saponins in Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis", Pharmaceutical Biology. 38(1), pp. 16-24. 46. Khaled R. and et al (2006), "Use of ginseng in medicine with emphasis on neurodegenerative disorders", Journal of Pharmacological Sciences. 100(3), pp. 175-186. 47. Kim H. J. and et al (1997), "Protection of rat liver microsomes against carbon tetrachloride-induced lipid peroxidation by red ginseng saponin through cytochrome P450 inhibition", Planta Medica. 63(5), pp. 415-418. 48. Kouichi Y. and et al (2012), "New triterpenoid saponins from fruit specimens of Panax japonicus collected in Toyama prefecture and Hokkaido", Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 60(6), pp. 728-735. 49. Kun Z. and et al (2002), "Dammarane-type triterpene saponins from Panax japonicus", J. Nat. Prod. 65(3), pp. 346–351.

46 50. Kyung Tack K. and et al (2007), "Protective
effect of steamed American ginseng (Panax quinquefolius L.) on V79-4 cells induced by oxidative stress", Journal of Ethnopharmacology. 111(3), pp. 443–450. 51. Lam S. K. and Ng T. B. (2002), "A xylanase from roots of sanchi ginseng (Panax notoginseng) with inhibitory effects on human immunodeficiency virus- 1 reverse transcriptase", Life Sciences. 70(25), pp. 3049–3058. 52. Lutomski J., Luan T.C. and Hoa T.T. (1992), "Polyacetylenes in the Araliaceae family. Part IV", Herba Polonica. 38(3), pp. 137-140. 53. Masayuki Y. and et al (2003), "Structures of new dammarane-type triterpene saponins from the flower buds of Panax notoginseng and hepatoprotective effects of principal ginseng saponins", J. Nat. Prod. 66(7), pp. 922-927. 54. Masayuki Y. and et al (2003), "Structures of new dammarane-type triterpene saponins from the flower buds of Panax notoginseng and hepatoprotective effects of principal ginseng saponins", J. Nat. Prod. 66(7), pp. 922-927. 55. Masayuki Y. and et al (1997), "Bioactive saponins and glycosides. VIII. notoginseng (1) : new dammarane-type triterpene oligoglycosides, notoginsenosides-A, -B, -C, and -D, from the dried root of Panax notoginseng (BURK.) F. H. CHEN", Chemical & pharmaceutical bulletin. 45(6), pp. 1039- 1045. 56. Minh Duc Nguyen and et al (1994), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. collected in Central Vietnam. II", Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 42(1), pp. 115-122. 57. Mun Chual R. and et al (2005), "Polyacetylenic compounds, ACAT inhibitors from the roots of Panax ginseng", Jounal of Agricultural and Food Chemistry. 53(4), pp. 919-922. 58. Nguyen Thi Thu Huong and et al (1996), "Efects of majonoside-R2 on pentobarbital sleep and gastric lesion in psychologically stressed mice", Pharmacology Biochemistry anh Behavior. 53, pp. 957-963. 59. Nobuyuki O. and et al (1994), "Protective effect of ginseng saponins against impaired brain growth in neonatal rats exposed to ethanol", Biological and Pharmaceutical Bulletin. 17(2), pp. 270-274. 60. Noriko F., Hiroyuki T. and Yukihiro S. (2000), "Isolation of the pharmacologically active saponin ginsenoside Rb1 from ginseng by immunoaffinity column chromatography", J. Nat. Prod. 63(2), pp. 283–285.

47 61. Omar M. E. A. S., Somaia A. N.
and Mahmoud S A. (2002), "The effect of ginseng on bile-pancreatic secretion in the rat. increase in proteins and inhibition of total lipids and cholesterol secretion", Pharmacological Research. 45(4), pp. 349–353. 62. Qi Zhen D. and et al (2003), "Isolation of dammarane saponins from Panax notoginseng by high-speed counter-current chromatography", Journal of Chromatography A. 1008(2), pp. 173-180. 63. Robbie Y. K. C. and et al (2002), "Estrogen-like activity of ginsenoside Rg1 derived from Panax notoginseng", Indocrinol. Metab. 87(8), pp. 3691-3695. 64. Rosemary B. D. and et al (2001), "American ginseng transcriptionally activates p21 mRNA in breast cancer cell lines ", J. Korean Med. Sci. 16, pp. Suppl: S54- 60. 65. Sakata T. and et al (1987), "Central effects of ginsenosides on the feeding behavior and response to stress in rats", Korea-Japan Panax Ginseng Symposium. 9, pp. 20-28. 66. Sang Jin C. and et al (2008), "Effects of a polyacetylene from Panax ginseng on Na+ currents in rat dorsal root ganglion neurons", Brain Research. 1191, pp. 75-83. 67. Sang Chul S., Hun Yeoung K. and Byung Hoon H. (1983), "Polyacetylenes from Panax ginseng roots", Phytochemistry. 22(8), pp. 1817-1818. 68. Seemann B. (1868), "On the genus Panax.", Journal of Botany (Moral). 6, pp. 52–58. 69. Shibata S. (2001), "Chemistry and cancer preventing activities of ginseng saponins and some related triterpenoid compounds", J.Korean Med. Sci. 16(suppl), pp. 28-37. 70. Shoji Y., Ryoji K. and Osamu T. (1977), "New dammarane type saponins of leaves of Panax japonicus C.A. MEYER. (1). chikusetsusaponins-L5, -L9a and -L10", Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 25(8), pp. 2041-2047. 71. Takao K. and et al (1999), "Cancer chemopreventive activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis", Cancer Letters. 147(1-2), pp. 11-16. 72. Takhtajan Armen L. (1980), "Outline of the classification of flowering plants (magnoliophyta)", The Botanical Review. 46(3), pp. 225-359.

48 73. Thi Hong Van Le and et al (2014),
"Processed Vietnamese ginseng: Preliminary results in chemistry and biological activity", Journal of ginseng research. 38(2), pp. 154–159. 74. Tran Q.L. and et al (2002), "Hepatoprotective effect of majonoside R2, the major saponin from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis)", Planta Medica. 68(5), pp. 402-406. 75. Un Ho J. and et al (2007), "Inhibitory effect of Panax notoginseng on nitric oxide synthase, cyclo-oxygenase-2 and neutrophil functions", Phytotherapy Research. 21(2), pp. 142–148. 76. Voces J. and et al (2004), "Ginseng administration protects skeletal muscle from oxidative stress induced by acute exercise in rats", Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 37(12), pp. 1863-1871. 77. Wang C. Z. and et al (2006), "Phytochemical and analytical studies of Panax notoginseng (Burk.) FH Chen", Journal of Natural Medicines. 60(2), pp. 97- 106. 78. Wen Kui L. and John F. F. (2001), "Determination of 24(R)-pseudoginsenoside F11 in North American ginseng using high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 25(2), pp. 257–265. 79. Wen Zhi Y. and et al (2014), "Saponins in the genus Panax L. (Araliaceae): A systematic review of their chemical diversity", 106, pp. 7-24. 80. Wolf Dieter R. and et al (2006), "Neuroprotective effects of ginsenosides", Acta Neurobiol Exp. 66(4), pp. 369-375. 81. Raven P. H. Wu Z. Y., Hong D. Y. (2007), Flora of China, Science Pressand, Beijing Missouri Botanical Garden Press,, St. Louis, pp. 489 - 491. 82. Xi Sheng X. and et al (2009), "Ginsenoside Rg1, a major active component isolated from Panax notoginseng, restrains tubular epithelial to myofibroblast transition in vitro", Journal of Ethnopharmacology. 122(1), pp. 35-41. 83. Yang Chong R. and et al (1985), "Two new oleanolic acid-type saponins from Panax stipuleanatus", Acta Botanica Yunnanica. 7, pp. 103-106. 84. Young Ho K., Ki Hyun P. and Hyune Mo R. (1996), "Transcriptional activation of the Cu,Zn-superoxide dismutase gene through the AP2 site by ginsenoside Rb2 extracted from a medicinal plant, Panax ginseng", The Journal of Biological Chemistry. 271, pp. 24539-24543.

49 85. Zhao R. and McDaniel W. F. (1998), "Ginseng
improves strategic learning by normal and brain‐damaged rats", 9. 7, pp. 1619-1624. 86. Zou K., Zhu S. and Katsuko K. (2002), "Analysis of saponins of Panax stipuleanatus by using HPLC and APIMS/MS techniques", J. Chin. Three Gorges Univ. 24, pp. 355-358. 87. Cheok Choon Y., Salman Hanaa Abdel K. and Sulaiman R. (2014), "Extraction and quantification of saponins: A review", Food Research International. 59, pp. 16-40. 88. Zhongbo W. (2007), "Determination of Oleanolic Acid Saponin in Panax japonicus CA Mey with Spectrophotometry", Journal of Anhui Agricultural Sciences. 35(26), pp. 8094.

i PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC

ii PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ
DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG Tam thất hoang (thân rễ) Dược liệu là thân rễ phơi hay sấy khô của cây tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng), họ Nhân sâm (Araliaceae). Mô tả: Thân rễ nằm ngang, có hình dạng thuôn dài, nhiều đốt và nhiều vết lõm, ít phân nhánh, dài 5-10 cm, đường kính 1,5-3,0 cm. Mặt ngoài màu nâu xám nhạt, nhiều rễ con nhỏ, dài, mọc thành dải. Chất tương đối cứng và giòn, dễ bẻ, mặt bẻ phẳng, màu vàng nâu, màu đậm hơn ở giữa. Mùi thơm hắc, vị ngọt hơi đắng. Vi phẫu: Lớp bầngồm 3-5 hàng tế bào hình chữ nhật, xếp xuyên tâm, bong tróc rất nhiều. Mô mềm vỏ gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác, rải rác có ống tiết chất nhựa và tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Libe-gỗ hình thoi xếp đều đặn, cách nhau bởi những tia tủy rộng. Tầng phát sinh libe-gỗ thành vòng liên tục. Mô mềm ruột gồm nhiều tế bào có kích thước lớn, chứa nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai và rải rác có ống tiết ly bào. Bột: Bột có màu vàng nhạt, mùi thơm hắc, vị ngọt hơi đắng. Mảnh bần là những tế bào hình chữ nhật, thành dày, màu xám . Mảnh mô mềm gồm các tế bào hình đa giác, thành mỏng, mang nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai có kích thước 20-25 μm. Các mảnh mạch gồm mạch mạng, mạch vạch, thường thấy mạch mạng. Hạt tinh bột đứng đơn lẻ hoặc tập trung thành đám, hình tròn có rốn rõ, kích thước 3-5 µm. Định tính: A. Lấy 1 g bột dược liệu, thêm 15 ml ethanol 70% (TT) đun trên cách thủy 10 phút, lọc. Lấy khoảng 1 ml dịch lọc pha loãng với nước cất thành 10 ml. Lắc mạnh 15 giây, có bọt bền. B. Phương pháp sắc ký lớp mỏng

iii Bản mỏng: Silica gel G Dung môi khai triển:
hệ dung môi n- butanol : acid acetic : nước (4:5:1), lấy lớp trên. Dung dịch thử: Lấy 1g bột dược liệu, thêm 10 ml methanol (TT), siêu âm 15 phút, lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký. Dung dịch đối chiếu: hòa 1 mg mỗi loại stipuleanosid R1 và stipuleanosid R2 trong 1 ml methanol (TT). Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký được khoảng 8-10 cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT), sấy ở 120ºC cho đến khi xuất hiện rõ vết. Các vết trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có màu sắc và giá trị Rf giống các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Độ ẩm: Không quá 10,0%. Tro toàn phần: Không quá 9,0%. Tro không tan trong acid: Không quá 2,0%. Định lượng: saponin tổng A. Định lượng theo phương pháp cân: Cân chính xác 10 g bột dược liệu đã rây qua rây số 335 (đã đươc đo độ ẩm) chiết Soxhlet với khoảng 100 ml n-hexan (TT) để loại chất béo (khoảng 8 giờ), lấy bã bay hết hơi n-hexan. Sau đó chiết bằng 100 ml methanol (TT). Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Hòa tan cắn trong 20 ml nước cất rồi lắc với n- butanol bão hòa nước (TT) đến khi lớp n-butanol nhạt màu. Gộp dịch n-butanol, rửa 3 lần bằng nước cất. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, hòa tan cắn bằng 2 ml ethanol 80% rồi chuyển vào một cốc đã được xác định khối lượng trước. Bốc hơi trên cách thủy được cắn. Sấy khô cắn ở 105ºC trong 3 giờ. Cân cắn. Tính hàm lượng saponin tổng theo công thức: Trong đó: X là hàm lượng saponin tổng trong dược liệu (%); Mc là khối lượng cao thu được (g);

iv Mt là khối lượng mẫu thử (g); A là
hàm ẩm dược liệu (%). Hàm lượng saponin tổng không dưới 3,0% tính theo dược liệu khô kiệt. B. Định lượng theo phương pháp đo quang: Cân chính xác khoảng 5,0 g bột dược liệu, chiết hồi lưu với ethanol 50% (tỉ lệ dung môi : dược liệu = 10 : 1) ở 70ºC trong 3 lần, mỗi lần 0,5 giờ. Lọc, gộp dịch chiết và loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn toàn phần. Cân chính xác khoảng 5,0 mg cắn pha trong ethanol tuyệt đối (TT) vừa đủ 10 ml thu được dung dịch thử có nồng độ 0,5 mg/ml. Lấy chính xác 1 ml dung dịch thử cho vào cốc có mỏ, bốc hơi đến cắn. Thêm 0,6 ml dung dịch vanilin/ acid acetic băng (50 mg/ml) (TT) và 1,2 ml acid perchloric (TT), ủ ở 70ºC trong 20 phút. Sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá và định mức 10 ml bằng acid acetic băng. Tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 550 nm. Các tính toán dựa trên phương trình đường chuẩn với dãy dung dịch chuẩn acid oleanolic có nồng độ từ 4 µg/ml đến 20 µg/ml và làm phản ứng màu như dung dịch thử. Hàm lượng saponin tổng trong dược liệu tam thất hoang tính theo acid oleanolic được tính theo công thức sau: Trong đó: C: nồng độ của acid oleanolic trong dung dịch mẫu thử (g/ml); k: hệ số pha loãng; A: hàm ẩm cao (%); B: Hàm ẩm dược liệu (%); mcao : khối lượng cao chiết được (g); mcân : khối lượng cao dùng định lượng (g); mdl : khối lượng dược liệu dùng định lượng (g) Hàm lượng saponin tổng không thấp hơn 8,0% tính theo dược liệu khô kiệt. Bảo quản Để nơi khô thoáng, tránh ẩm mốc. Tính vị, quy kinh Tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng, tính ấm. Quy kinh can, vị. Công năng, chủ trị

v Tán ứ, định thống. Chủ trị: dùng làm thuốc
bổ, cầm máu, tăng cường sinh lực, chống stress. Chế biến Thu hoạch thân rễ vào tháng 9-12, lấy về rửa sạch, phơi khô hoặc sấy nhiệt độ dưới 60ºC.

Củ tam thất bắc điều trị ung thư

Củ tam thất bắc điều trị ung thư

Other Decks in How-to & DIY

Featured

Transcript