University of Virginia - Biochemistry and Molecular Genetics Seminar - April 2016

Talk presented at the UVa BMG Departmental Seminar Series on 4/28/16 entitled "Informing GWAS using Co-expression Networks"

Transcript

1. Informing GWAS using Co-expression Networks Charles R. Farber, Ph.D. Center for Public Health Genomics University of Virginia @cr_farber crf2s@virginia.edu farberlab.com Biochemistry and Molecular Genetics, Thursday Seminar, UVa, 4/28/16 Slides on speakerdeck.com
2. Bone Strength
3. Bone Strength Mouse Genetics Osteoblast activity Bone strength OVX-induced bone loss
4. Bone Strength Mouse Genetics Osteoblast activity Bone strength OVX-induced bone loss
5. Bone Strength Mouse Genetics Osteoblast activity Bone strength OVX-induced bone loss Human Genetics Functional follow-up of BMD GWAS associations
6. Bone Strength Mouse Genetics Osteoblast activity Bone strength OVX-induced bone loss Human Genetics Functional follow-up of BMD GWAS associations
7. Condition of reduced bone strength 12 million cases in U.S. - 1.5 million fractures Costly - ~$18 billion 25% mortality within one year of fracture - 50% don’t return to independent living Osteoporosis http://www.neuros.net/en/osteoporosis.php
8. Bone Remodeling Seeman, E., & Delmas, P. D. (2006). Bone quality--the material and structural basis of bone strength and fragility. The New England Journal of Medicine, 354(21), 2250–2261.
9. Hip BMD T-score BMD is associated with osteoporotic fracture Cummings SR et al. JAMA. 2002. Genetics of Osteoporosis
10. Hip BMD T-score BMD is associated with osteoporotic fracture Cummings SR et al. JAMA. 2002. BMD is highly heritable h2=0.6-0.8 and clinically accessible Genetics of Osteoporosis
11. Genome-Wide Association Study (GWAS) Genotype at millions of SNPs
12. Genome-Wide Association Study (GWAS) Genotype at millions of SNPs 94 94.75 95.5 96.25 97 CC CT TT Genotype BMD (mg/cm2)
13. Why GWAS? “Overall, we estimate that drug mechanisms with genetic support would succeed twice as often as those without it (from phase I to approval).”
14. Why GWAS? “Overall, we estimate that drug mechanisms with genetic support would succeed twice as often as those without it (from phase I to approval).”
15. Why GWAS? Richards, J. B., Zheng, H.-F., & Spector, T. D. (2012). Genetics of osteoporosis from genome- wide association studies: advances and challenges. Nature Reviews Genetics, 13(8), 576–588. “Overall, we estimate that drug mechanisms with genetic support would succeed twice as often as those without it (from phase I to approval).”
16. BMD GWAS • GEFOSII meta-analysis of FNBMD and LSBMD in ~32K with replication in ~50K (Estrada, et al. (2012). Nature Genetics. 44(5), 491–501) • 64 independent associations influencing FNBMD and/or LSBMD
17. 0 2 4 6 8 10 −log10 (p−value) 0 20 40 60 80 100 Recombination rate (cM/Mb) • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • ••• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • rs11228262 0.2 0.4 0.6 0.8 r2 CHKA SUV420H1 C11orf24 LRP5 PPP6R3 GAL MTL5 CPT1A MRPL21 IGHMBP2 68 68.2 68.4 68.6 Position on chr11 (Mb) Plotted SNPs
18. How to go from locus to gene to mechanism? 1. Gene(s) 2. Function 0 2 4 6 8 10 −log10 (p−value) 0 20 40 60 80 100 Recombination rate (cM/Mb) • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • ••• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • rs11228262 0.2 0.4 0.6 0.8 r2 CHKA SUV420H1 C11orf24 LRP5 PPP6R3 GAL MTL5 CPT1A MRPL21 IGHMBP2 68 68.2 68.4 68.6 Position on chr11 (Mb) Plotted SNPs
19. 1. Genes that influence a disease are often functionally related (Goh, K.-I. et al. 2007. PNAS) 2. Functionally related genes are often co-expressed (Nayak, R. R. et al. 2009. Genome Research) Observations
20. Connection Strength Weighted Gene Co- Expression Network Analysis (WGCNA) Zhang and Horvath. 2005. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 4: Article17. Samples Expression
21. Co-Expression Network Cell Cycle P=4.0 x 10-30 Mitochondria P=1.1 x 10-64 Extracellular Matrix P=1.9 x 10-16 Extracellular Matrix P=4.4 x 10-20 Ribosome P=5.1 x 10-14
22. Co-expression networks are like fly boxes
23. GWAS Data Map GWAS genes onto network Modules containing more genes implicated by GWAS than expected by chance Genes implicated by GWAS Characterize modules; make predictions regarding causal genes and their mechanisms of action Genome-wide co-expression relationships from a disease-relevant tissue Co-expression Network The Approach
24. http://www.maxi-file.com/wp-content/uploads/2012/02/carousel-filing-system-lateral-filing-shelves-Maxi-File-850x409.jpg
25. http://www.maxi-file.com/wp-content/uploads/2012/02/carousel-filing-system-lateral-filing-shelves-Maxi-File-850x409.jpg Osteoblast Genes Osteoblast Differentiation Cell Adhesion
26. Gene X Gene Y Gene Z Gene A Gene B Gene C Non-Causal Causal GWAS loci
27. Gene X Gene Y Gene Z Gene A Gene B Gene C Non-Causal Causal GWAS loci Functionally related and co- expressed
28. Gene X Gene Y Gene Z Gene A Gene B Gene C Non-Causal Causal GWAS loci Functionally related and co- expressed Genes located within GWAS loci
29. Gene X Gene Y Gene Z Gene A Gene B Gene C Non-Causal Causal GWAS loci Functionally related and co- expressed Genes located within GWAS loci
30. Enriched co-expression modules Gene X Gene Y Gene Z Gene A Gene B Gene C Non-Causal Causal GWAS loci Functionally related and co- expressed Genes located within GWAS loci
31. Enriched co-expression modules Gene X Gene Y Gene Z Gene A Gene B Gene C Non-Causal Causal GWAS loci Functionally related and co- expressed Genes located within GWAS loci Gene X Gene Y Gene Z Prioritize Genes Predict Function
32. 64 SNPs P<5.0 x 10-8 234 Genes Bone transcriptomic profiles from male mice of 96 inbred mouse strains (Calabrese et al. 2012. PLoS Genetics) Genome-wide co-expression network GEFOSII BMD GWAS (N~80K) (Estrada, K., et al. 2012. Nature Genetics)
33. GWAS gene enrichment in modules 6 and 9 0 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Module −log10(Enrichment P-value) 6 9
34. GWAS gene enrichment in modules 6 and 9 0 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Module −log10(Enrichment P-value) 6 9 • Enriched for genes with well- known roles in osteoblasts • Preferentially expressed in osteoblast-lineage cells
35. ME15 ME10 ME2 ME18 ME7 ME5 ME14 ME12 ME9 ME6 ME20 ME4 ME19 ME8 ME17 ME21 ME1 ME13 ME3 ME16 ME0 ME11 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Modules Distance B C E −0.2 0.0 0.2 −0.3 −0.2 −0.1 0.0 0.1 0.2 Module 9 Eigengene Module 6 Eigengene r=0.63, P=6.4 x 10-12 20 g10P) r=0.44, P=3.8 x 10-10 Extracellular Matrix Collagen Trimer F GWAS gene enrichment in modules 6 and 9
36. ME15 ME10 ME2 ME18 ME7 ME5 0.0 0.5 1.0 1.5 2 Distance D E 0 5 10 15 2 4 6 5 10 15 20 5 10 15 20 25 Module 6 GO enrichments (-log10P) Module 9 GO enrichments (-log10P) Module 6 GO (Fold Enrichment) Module 9 GO (Fold Enrichement) r=0.44, P=3.8 x 10-10 r=0.77, P<2.2 x 10-16 Collagen Trimer Positive Regulation of Bone Mineralization Skeletal System Development Osteoblast Differentiation Ossification Extracellular Matrix Extracellular Matrix Collagen Trimer Osteoblast Differentiation Skeletal System Development Positive Regulation of Bone Mineralization Ossification 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 − Module GWAS gene enrichment in modules 6 and 9
37. GWAS SNP Chr SNP Mbp Gene Novel rs7521902 1 22.164 WNT4 NO rs6426749 1 22.385 WNT4 NO rs17482952 1 68.174 WLS NO rs12407028 1 68.182 WLS NO rs479336 1 172.23 DNM3OS NO rs1346004 2 165.745 GALNT3 NO rs6532023 4 87.853 MEPE NO rs1366594 5 89.08 MEF2C NO rs13245690 7 121.145 WNT16 NO rs3801387 7 121.335 WNT16 NO rs2062377 8 118.995 TNFRSF11B NO rs1373004 10 52.668 DKK1 NO rs7932354 11 46.701 LRP4 NO rs3736228 11 68.434 LRP5 NO rs2887571 12 1.529 WNT5B NO rs2016266 12 53.334 SP7 NO rs736825 12 54.024 HOXC6 NO rs1564981 16 50.952 CYLD NO rs1566045 16 50.988 CYLD NO rs4792909 17 43.721 MEOX1 NO rs4792909 17 43.721 SOST NO rs227584 17 44.148 HDAC5 NO GWAS SNP Chr SNP Mbp Gene Novel rs4233949 2 54.433 SPTBN1 YES rs17040773 2 111.742 MERTK YES rs13245690 7 121.145 CPED1 YES rs3801387 7 121.335 FAM3C YES rs2062377 8 118.995 SAMD12 YES rs7851693 9 130.603 FUBP3 YES rs7071206 10 77.642 KCNMA1 YES rs7071206 10 77.642 DLG5 YES rs7108738 11 15.689 INSC YES rs3736228 11 68.434 PPP6R3 YES rs1053051 12 106.973 TMEM263 YES rs11623869 14 103.417 MARK3 YES rs4790881 17 2.166 HIC1 YES rs4790881 17 2.166 SMG6 YES rs3790160 20 10.659 BTBD3 YES Osteoblast Functional Module (OFM) Prediction: OFM genes are causal and they influence BMD via altering osteoblast activity
38. BTBD3 CPED1 DLG5 FAM3C FUBP3 HIC1 INSC KCNMA1 MARK3 MERTK PPP6R3 SMG6 SAMD12 SPTBN1 TMEM263 WNT5B 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.0 5.5 6.0 6.5 2.6 2.8 3.0 3.2 1.0 1.5 2.0 2.5 0.5 1.0 1.5 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 1.5 2.0 2.5 3.0 4.1 4.2 4.3 4.4 3.2 3.6 4.0 0.4 0.8 1.2 1.6 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 d2 d4 d6 d8d10 d12 d14 d16 d18 d2 d4 d6 d8d10 d12 d14 d16 d18 d2 d4 d6 d8d10 d12 d14 d16 d18 d2 d4 d6 d8d10 d12 d14 d16 d18 Day mean RPKM Novel OFM gene expression differs as a function of osteoblast differentiation
39. ARHGAP1 ZNF408 KCNMA1 HOXC6 C17orf53 HOXC5 WNT16 SP7 TMEM263 F2 WNT4 SPTBN1 FUBP3 HDAC5 PPP6R3 MEPE MARK3 SOST PFDN5 TNFRSF11B ATXN7L3 WLS WLS PRDM12 FAM3C ESPL1 ZBTB40 COLEC10 WNT5B C2orf73 CKB HIC1 TRMT61A DIRAS3 SPP1 DIRAS3 SMG6 SRR ANAPC1 CPED1 ASS1 SALL1 MEF2C WNT16 C1orf105 ING3 SALL1 CYLD LRP4 SLX4IP WNT4 RPE65 CSRNP3 RPE65 DLG5 ZBTB40 DKK1 SAMD12 DNM3 ERC1 INSC BCL2L11 SOX6 BTBD3 CETN3 GALNT3 MEOX1 DNM3OS MBL2 LRP5 MERTK CYLD AAAS MTERF2 JAG1 ASB16 HOXC4 C12orf10 TMUB2 ATG13 CKAP5 5 10 15 20 0 10 20 30 log2(bp to TSS) OFM NONOFM GWAS locus 0 20 40 60 80 100 GWAS regions (%) Closest to lead SNP Not closest to lead SNP OFM Genes NOFM Genes 0 20 40 60 80 100 Genes (%) OFM Genes NOFM Genes Closest to lead SNP Not closest to lead SNP A B C OFM genes are closer than non-OFM genes to lead BMD SNPs
40. Genes Non-OFM GWAS association Genes OFM GWAS association SNPs Reg. Elements SNPs Reg. Elements OFM gene
41. Genes Non-OFM GWAS association Genes OFM GWAS association SNPs Reg. Elements SNPs Reg. Elements OFM gene
42. Genes Non-OFM GWAS association Genes OFM GWAS association SNPs Reg. Elements SNPs Reg. Elements OFM gene
43. Genes Non-OFM GWAS association Genes OFM GWAS association SNPs Reg. Elements SNPs Reg. Elements OFM gene
44. Genes Non-OFM GWAS association Genes OFM GWAS association SNPs Reg. Elements SNPs Reg. Elements OFM gene
45. Genes Non-OFM GWAS association Genes OFM GWAS association SNPs Reg. Elements SNPs Reg. Elements OFM gene
46. 0 10 20 30 40 50 H3K27ac H3K4me1 H3K4me2 H3K4me3 H3K79me2 H3K36me3 H3K9me3 H3K27me3 Overlap (%) SNP Group OFM (N=30) NOFM (N=34) P=8.0 x 10-3 P=0.02 OFM matched random SNP set P<0.001 P<0.001 P<0.001 OSTEOBLASTS CHONDROCYTES MESENCHYMAL STEM CELLS CD184+ ENDODERM CELLS PREFRONTAL CORTEX FORESKIN FIBROBLAST 10 20 30 40 −0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 Difference (% OFM overlap - % NOFM overlap) Overlap (%) ADRENAL BLOOD BONE BRAIN BREAST CERVIX ESC ESC_DERIVED FAT GI_COLON GI_DUODENUM GI_ESOPHAGUS GI_INTESTINE GI_RECTUM GI_STOMACH HEART IPSC LIVER LUNG MUSCLE MUSCLE_LEG OVARY PANCREAS PLACENTA SKIN SPLEEN STROMAL_CONNECTIVE THYMUS VASCULAR H3K27ac IMR90 LUNG FIBROBLASTS MYOBLASTS MYOTUBES LUNG FIBROBLASTS OSTEOBLASTS 10 20 30 0.1 0.2 0.3 BLOOD BONE BRAIN BREAST CERVIX ESC ESC_DERIVE LIVER LUNG MUSCLE SKIN VASCULAR H3K4me2 Difference (% OFM overlap - % NOFM overlap) A B E OFM locus OFM gene OFM locus NOFM gene NOFM locus NOFM gene Expression (log 2 (AU)) C P=0.02 P=0.009 0 20 40 60 80 100 Overlap (%) Regulatory Elements Quiessent or repressed regions OFM (N=30) NOFM (N=34) D ChromHMM Segmentation 25-state model in Osteoblasts 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 BMD GWAS SNPs in OFM loci overlap regulatory elements in osteoblasts
47. 0 10 20 30 40 50 H3K27ac H3K4me1 H3K4me2 H3K4me3 H3K7 Overlap (%) P=8.0 x 10-3 P=0.02 P<0.001 P<0.001 P<0.001 F 10 20 30 40 −0.1 Diffe Overlap (%) H3K A OFM locus OFM gene OFM locus NOFM gene NOFM locus NOFM gene Expression (log 2 (AU)) C P=0.02 P=0.009 D 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 0 10 20 30 40 50 H3K27ac H3K4me1 H3K4me2 H3K4me3 H3K79me2 H3K36me3 H3K9me3 H3K27me3 Overlap (%) SNP Group OFM (N=30) NOFM (N=34) P=8.0 x 10-3 P=0.02 OFM matched random SNP set P<0.001 P<0.001 P<0.001 OSTEOBLASTS CHONDROCYTES MESENCHYMAL STEM CELLS CD184+ ENDODERM CELLS PREFRONTAL CORTEX FORESKIN FIBROBLAST 10 20 30 40 −0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 Difference (% OFM overlap - % NOFM overlap) Overlap (%) ADRENAL BLOOD BONE BRAIN BREAST CERVIX ESC ESC_DERIVED FAT GI_COLON GI_DUODENUM GI_ESOPHAGUS GI_INTESTINE GI_RECTUM GI_STOMACH HEART IPSC LIVER LUNG MUSCLE MUSCLE_LEG OVARY PANCREAS PLACENTA SKIN SPLEEN STROMAL_CONNECTIVE THYMUS VASCULAR H3K27ac IMR90 LUNG FIBROBLASTS MYOBLASTS MYOTUBES LUNG FIBROBLASTS OSTEOBLASTS 10 20 30 0.1 0.2 0.3 BLOOD BONE BRAIN BREAST CERVIX ESC ESC_DERIVE LIVER LUNG MUSCLE SKIN VASCULAR H3K4me2 Difference (% OFM overlap - % NOFM overlap) A B E OFM locus OFM gene OFM locus NOFM gene NOFM locus NOFM gene Expression (log 2 (AU)) C P=0.02 P=0.009 0 20 40 60 80 100 Overlap (%) Regulatory Elements Quiessent or repressed regions OFM (N=30) NOFM (N=34) D ChromHMM Segmentation 25-state model in Osteoblasts 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 BMD GWAS SNPs in OFM loci overlap regulatory elements in osteoblasts
48. 2 H3K4me3 H3K79me2 H3K36me3 H3K9me3 H3K27me3 P<0.001 OSTEOBLASTS CHONDROCYTES MESENCHYMAL STEM CELLS CD184+ ENDODERM CELLS PREFRONTAL CORTEX FORESKIN FIBROBLAST 10 20 30 40 −0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 Difference (% OFM overlap - % NOFM overlap) Overlap (%) ADRENAL BLOOD BONE BRAIN BREAST CERVIX ESC ESC_DERIVED FAT GI_COLON GI_DUODENUM GI_ESOPHAGUS GI_INTESTINE GI_RECTUM GI_STOMACH HEART IPSC LIVER LUNG MUSCLE MUSCLE_LEG OVARY PANCREAS PLACENTA SKIN SPLEEN STROMAL_CONNECTIVE THYMUS VASCULAR H3K27ac IMR90 LUNG FIBROBLASTS MYOBLASTS MYOTUBES LUNG FIBROBLASTS OSTEOBLASTS 10 20 30 0.1 0.2 0.3 BLOOD BONE BRAIN BREAST CERVIX ESC ESC_DERIVED LIVER LUNG MUSCLE SKIN VASCULAR H3K4me2 Difference (% OFM overlap - % NOFM overlap) E M locus M gene 0 20 40 60 Overlap (%) Quiessent or repressed regions OFM (N=30) NOFM (N=34) D Overlap between lead BMD SNPs in OFM loci and regulatory elements is osteoblast-specific
49. 0 2 4 6 8 10 12 −log10 (p−value) 0 20 40 60 80 100 Recombination rate (cM/Mb) rs4233949 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 0.2 0.4 0.6 0.8 r2 ACYP2 TSPYL6 C2orf73 SPTBN1 54.5 54.6 54.7 54.8 Position on chr2 (Mb) A +/+ +/+ Sptbn1-/- Sptbn1-/- Female Male BMD ( residuals) B C −0.006 −0.004 −0.002 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 Genotype P=0.0014 Sex Interaction P=0.0002 −0.006 −0.004 −0.002 0.000 0.002 0.004 BMD ( residuals) Genotype P=0.51 +/+ +/+ 4930505A04Rik-/- 4930505A04Rik-/- Female Male SPTBN1 is a candidate for a BMD GWAS locus on Chr. 2p16.2
50. 0 2 4 6 8 10 12 −log10 (p−value) 0 20 40 60 80 100 Recombination rate (cM/Mb) rs4233949 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 0.2 0.4 0.6 0.8 r2 ACYP2 TSPYL6 C2orf73 SPTBN1 54.5 54.6 54.7 54.8 Position on chr2 (Mb) A +/+ +/+ Sptbn1-/- Sptbn1-/- Female Male BMD ( residuals) B C −0.006 −0.004 −0.002 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 Genotype P=0.0014 Sex Interaction P=0.0002 −0.006 −0.004 −0.002 0.000 0.002 0.004 BMD ( residuals) Genotype P=0.51 +/+ +/+ 4930505A04Rik-/- 4930505A04Rik-/- Female Male SPTBN1 is a candidate for a BMD GWAS locus on Chr. 2p16.2
51. 0 2 4 6 8 10 12 −log10 (p−value) 0 20 40 60 80 100 Recombination rate (cM/Mb) rs4233949 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 0.2 0.4 0.6 0.8 r2 ACYP2 TSPYL6 C2orf73 SPTBN1 54.5 54.6 54.7 54.8 Position on chr2 (Mb) A +/+ +/+ Sptbn1-/- Sptbn1-/- Female Male BMD ( residuals) B C −0.006 −0.004 −0.002 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 Genotype P=0.0014 Sex Interaction P=0.0002 −0.006 −0.004 −0.002 0.000 0.002 0.004 BMD ( residuals) Genotype P=0.51 +/+ +/+ 4930505A04Rik-/- 4930505A04Rik-/- Female Male SPTBN1 is a candidate for a BMD GWAS locus on Chr. 2p16.2
52. Chr14q32.32 GWAS locus Estrada, K. et al. (2012). Nature Genetics. 0 1 2 3 4 5 6 7 rs11623869 • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • 0.2 0.4 0.6 0.8 r2 GEFOSII Femoral Neck BMD EIF5 SNORA28 MARK3 CKB TRMT61A BAG5 APOPT1 103.75 103.8 103.85 103.9 103.95 104 Position on chr14 (Mb) -log10(P-value)
53. Chr14q32.32 GWAS locus Estrada, K. et al. (2012). Nature Genetics. 0 1 2 3 4 5 6 7 rs11623869 • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • 0.2 0.4 0.6 0.8 r2 GEFOSII Femoral Neck BMD EIF5 SNORA28 MARK3 CKB TRMT61A BAG5 APOPT1 103.75 103.8 103.85 103.9 103.95 104 Position on chr14 (Mb) -log10(P-value) 9.00 9.25 9.50 9.75 10.00 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 Femoral BMD (g/cm2) Bone Mark3 Expression (log 2 (INT)) r=-0.25, P=0.036
54. Chr14q32.32 GWAS locus Estrada, K. et al. (2012). Nature Genetics. 0 1 2 3 4 5 6 7 rs11623869 • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • 0.2 0.4 0.6 0.8 r2 GEFOSII Femoral Neck BMD EIF5 SNORA28 MARK3 CKB TRMT61A BAG5 APOPT1 103.75 103.8 103.85 103.9 103.95 104 Position on chr14 (Mb) -log10(P-value) 9.00 9.25 9.50 9.75 10.00 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 Femoral BMD (g/cm2) Bone Mark3 Expression (log 2 (INT)) r=-0.25, P=0.036 Mark3 Osteoblast activity & BMD
55. Mark3 • Serine-Theronine Kinase • 753 aa • Mammalian homologue of Par1 (C. elegans) in mammals (along with Mark1, -2 and -4) • Implicated in pancreatic and hepatocarcinogenesis (Kato T et al. (2001) Neoplasia and Parsa I (1988) Cancer Res.) • Metabolism
56. Lennerz JK et al. (2010) Loss of Par-1a/MARK3/C-TAK1 kinase leads to reduced adiposity, resistance to hepatic steatosis and defective gluconeogenesis. Mol Cell Biol. doi:10.1128/MCB.01472-09. Mark3 • Serine-Theronine Kinase • 753 aa • Mammalian homologue of Par1 (C. elegans) in mammals (along with Mark1, -2 and -4) • Implicated in pancreatic and hepatocarcinogenesis (Kato T et al. (2001) Neoplasia and Parsa I (1988) Cancer Res.) • Metabolism
57. Mark3 is expressed in osteoblast-lineage cells
58. Mark3 is expressed in osteoblast-lineage cells DAPI MARK3 Phalloidin DAPI MARK3 Phalloidin
59. Primary calvarial osteoblasts Mark3 siRNAs Differentiate Quantify Mineralization Mark3 knockdown in vitro increases mineralization
60. Primary calvarial osteoblasts Mark3 siRNAs Differentiate Quantify Mineralization 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 SC Mark3 1 Mark3 2 Mark3 Relative Expression P<0.01 Mark3 knockdown in vitro increases mineralization
61. Primary calvarial osteoblasts Mark3 siRNAs Differentiate Quantify Mineralization SC Mark3_1 Mark3_2 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 SC Mark3 1 Mark3 2 Mark3 Relative Expression P<0.01 Mark3 knockdown in vitro increases mineralization
62. Primary calvarial osteoblasts Mark3 siRNAs Differentiate Quantify Mineralization SC Mark3_1 Mark3_2 0.09 0.12 0.15 0.18 0.21 Alizarin Red (mM) SC Mark3 1 Mark3 2 P<0.05 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 SC Mark3 1 Mark3 2 Mark3 Relative Expression P<0.01 Mark3 knockdown in vitro increases mineralization
63. Generation of a Mark3 Global Gene Trap/Conditional Mouse 0.0 0.4 0.8 1.2 Mark3+/+ Mark3 tm1a/+ Mark3 tm1a/tm1a Genotype Mark3 Relative Expression P<0.01
64. Generation of a Mark3 Global Gene Trap/Conditional Mouse 0.0 0.4 0.8 1.2 Mark3+/+ Mark3 tm1a/+ Mark3 tm1a/tm1a Genotype Mark3 Relative Expression P<0.01
65. 9.00 9.25 9.50 9.75 10.00 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 HMDP Femoral BMD (g/cm2) HMDP Mark3 Expression (log2 (INT)) r=-0.25, P=0.036 Mark3 knockdown in vivo increases cortical BMD
66. 9.00 9.25 9.50 9.75 10.00 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 HMDP Femoral BMD (g/cm2) HMDP Mark3 Expression (log2 (INT)) r=-0.25, P=0.036 0.050 0.052 0.054 0.056 12 16 Age Spine BMD (g/cm2) 0.065 0.070 0.075 0.080 12 16 Age Femur BMD (g/cm2) * * 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 +/+ +/- -/- Genotype Mark3 Relative Expression Genotype +/+ +/- Genotype +/+ +/- P<0.05 Mark3 knockdown in vivo increases cortical BMD
67. 9.00 9.25 9.50 9.75 10.00 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 HMDP Femoral BMD (g/cm2) HMDP Mark3 Expression (log2 (INT)) r=-0.25, P=0.036 0.050 0.052 0.054 0.056 12 16 Age Spine BMD (g/cm2) 0.065 0.070 0.075 0.080 12 16 Age Femur BMD (g/cm2) * * 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 +/+ +/- -/- Genotype Mark3 Relative Expression Genotype +/+ +/- Genotype +/+ +/- P<0.05 20 30 40 50 +/+ -/- Genotype BA/TA (%) 0.05 0.10 0.15 0.20 Genotype Ct.Th (mm) 1000 1050 1100 1150 1200 Genotype TMD (mg HA/cm3) * * * Femur (cortical bone) +/+ -/- +/+ -/- Mark3 knockdown in vivo increases cortical BMD
68. 9.00 9.25 9.50 9.75 10.00 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 HMDP Femoral BMD (g/cm2) HMDP Mark3 Expression (log2 (INT)) r=-0.25, P=0.036 0.050 0.052 0.054 0.056 12 16 Age Spine BMD (g/cm2) 0.065 0.070 0.075 0.080 12 16 Age Femur BMD (g/cm2) * * 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 +/+ +/- -/- Genotype Mark3 Relative Expression Genotype +/+ +/- Genotype +/+ +/- P<0.05 20 30 40 50 +/+ -/- Genotype BA/TA (%) 0.05 0.10 0.15 0.20 Genotype Ct.Th (mm) 1000 1050 1100 1150 1200 Genotype TMD (mg HA/cm3) * * * Femur (cortical bone) +/+ -/- +/+ -/- 0 3 6 9 Genotype BV/TV (%) 0 1 2 3 4 Genotype Tb.N (1/mm) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Genotype Tb-Th (mm) 0.0 0.1 0.2 Genotype Tb.Sp (mm) * Femur (trabecular bone) +/+ -/- +/+ -/- +/+ -/- +/+ -/- Mark3 knockdown in vivo increases cortical BMD
69. rs11623869 Proxies 50 kb hg19 103,900,000 103,950,000 104,000,000 MARK3 CKB TRMT61A rs11623869 Osteobl H3K4m2 50 _ 1 _ Osteobl H3K27ac 50 _ 1 _ Chr 14 Thyroid Prostate Pituitary Breast − Mammary Tissue Skin − Sun Exposed (Lower leg) Skin − Not Sun Exposed (Suprapubic) Pancreas Adipose − Subcutaneous Nerve − Tibial 0.0 0.2 0.4 0.6 rs11623869 “T” (standardized allele effect) Tissue BMD 5.2 x 10-16 5.2 x 10-16 1.2 x 10-12 4.1 x 10-7 4.1 x 10-9 2.9 x 10-11 1.0 x 10-10 4.6 x 10-10 1.7 x 10-8 1.2 x 10-42 MARK3 is candidate for a BMD GWAS locus on Chr. 14q32.32
70. rs11623869 Proxies 50 kb hg19 103,900,000 103,950,000 104,000,000 MARK3 CKB TRMT61A rs11623869 Osteobl H3K4m2 50 _ 1 _ Osteobl H3K27ac 50 _ 1 _ Chr 14 Thyroid Prostate Pituitary Breast − Mammary Tissue Skin − Sun Exposed (Lower leg) Skin − Not Sun Exposed (Suprapubic) Pancreas Adipose − Subcutaneous Nerve − Tibial 0.0 0.2 0.4 0.6 rs11623869 “T” (standardized allele effect) Tissue BMD 5.2 x 10-16 5.2 x 10-16 1.2 x 10-12 4.1 x 10-7 4.1 x 10-9 2.9 x 10-11 1.0 x 10-10 4.6 x 10-10 1.7 x 10-8 1.2 x 10-42 MARK3 GTEX Thyroid 0 10 20 30 40 −log10 (p−value) • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • rs11623869 0.2 0.4 0.6 0.8 r2 EIF5 SNORA28 MARK3 CKB TRMT61A BAG5 APOPT1 103.75 103.8 103.85 103.9 103.95 104 Position on chr14 (Mb) 0 5 10 15 20 25 −log10 (p−value) • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • rs11623869 0.2 0.4 0.6 0.8 r2 EIF5 SNORA28 MARK3 CKB TRMT61A BAG5 APOPT1 103.75 103.8 103.85 103.9 103.95 104 Position on chr14 (Mb) CKB GTEX Skeletal Muscle 0 2 4 6 8 10 −log10 (p−value) • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • ••• • • • • • • • • • • • • • • • • • rs11623869 0.2 0.4 0.6 0.8 r2 EIF5 SNORA28 MARK3 CKB TRMT61A BAG5 APOPT1 103.75 103.8 103.85 103.9 103.95 104 Position on chr14 (Mb) TRMT61A GTEX Aorta PP4=97.4% PP3=2.5% PP4=26.1% PP3=68.7% PP4=93.5% PP3=5.2% MARK3 is candidate for a BMD GWAS locus on Chr. 14q32.32
71. Conclusions • By overlaying GWAS information on a disease-relevant co-expression network we predicted causal genes for 30 of 64 GWAS loci • MARK3 is likely responsible for a GWAS locus on Chr. 14q32.32 • Approach could be useful for GWAS for many diseases
72. Future Directions • Bone transcriptomics data - R01 in June • Identify casual variants at MARK3 locus and determine if its effect on BMD is osteoblast-specific - R01 in October • Height GWAS - ~500 loci
73. Farber Lab • Gina Calabrese • Larry Mesner, Ph.D. • Olivia Sabik • Basel Al-Barghouthi UCLA • Jake Lusis, Ph.D. • Brian Bennett, Ph.D. • Luz Orozco, Ph.D. • Calvin Pan • Anatole Ghazalpour, Ph.D. • Hyun Min Kang, Ph.D. • Eleazar Eskin, Ph.D. Maine Medical Center Research Institute • Cliff Rosen, M.D. Yale • Mark C. Horowitz, Ph.D. • Steve Tommasini, Ph.D. University of Maryland • Joe Stains, Ph.D. R01-AR057759 R01-AR064790 R01-AR068345