Was ist Crispr-Cas9?

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1. CRISPR/Cas9 Biotechnologie- Paul Lorenzo
2. Gliederung • Einführung • Vireninfektion in Bakterien • CRISPR/Cas9 Prokaryoten • Genome editing Eukaryoten • CRISPR/Cas9 in Eukaryoten • CRISPR/Cas9 in Eukaryoten- Pflanzenzelle
3. Einführung • In den Ende 80er Jahren wurden bestimmte Sequenzen in E.coli entdeckt, die als sich wiederholende Sequenzen bezeichnet wurden • Diese Sequenzen wurden in den 90er Jahren auch in anderen Bakterien gefunden • Erst 2007 wurde bekannt, welche Aufgabe diese Sequenzen in den Bakterien haben
4. Einführung Wieso/weshalb/warum? • Was heißt CRISPR/Cas9? • Wo ist es zu finden? • Wozu dient es? • CRISPR= Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats • In Bakterien zur Abwehr von Bakteriophagen • Dient Bakterien als Immunantwort auf Viren
5. Vireninfektion in Bakterien • Wie infizieren Bakteriophagen Bakterien? https://www.aerztezeitung.de/medizin/krankheiten/infektionskrankheiten/mre/article/917431/kampf- mrsa-weist-phagentherapie-weg.html
6. Vireninfektion in Bakterien Lytisches System Lysogenes System
7. CRISPR/Cas9 Prokaryoten • Diesem viralen Angriff ist das Bakterium nicht schutzlos ausgeliefert! Natürliches Immunsystem der Bakterien, um Bakteriophagen abzuwehren, indem virale DNA-Abschnitte ins Genom der Bakterien eingebaut werden Wie funktioniert diese Immunisierung??
8. CRISPR/Cas9 Prokaryoten • CRISPR-Locus hat repetitive Sequenzen: Palindrome & Spacer • Palindrom: Sequenzen können in beide Richtungen abgelesen werden: 5‘-3‘ -> 3‘-5‘ • Spacer: Sequenzen aus der viralen DNA; Unterbrechen die repetitiven Palindrome • Cas-Gene: Cas9 (Enzyme: Helikasen, Nukleasen) • crRNA: Crispr-RNA • tracrRNA: Trans-activating Crispr- RNA
9. CRISPR/Cas9 Prokaryoten
10. Genome editing Eukaryoten • Welche Methoden zum Genome editing werden in Eukaryoten verwendet?
11. Genome editing Eukaryoten • Mit welchen Methoden lassen sich Gene einer eukaryotische Zelle verändern? • Zinkfinger: • In den 90er Jahren wurde die Zinkfinger- Methode zur Veränderung des Genoms entdeckt • DNA wird ortsspezifisch erkannt und geschnitten • Zinkfinger-Proteindomäne+Nuklease-Domäne docken an DNA an und schneiden diese
12. Genome editing Eukaryoten • Mit welchen Methoden lassen sich Gene einer eukaryotische Zelle verändern? • TALENs: • Transcription Activator-Like Effector Nucleases • 2009/2010 wurde diese Methode des Genome editings publiziert • Proteine, die mit Nuklease- Domäne DNA erkennen und schneiden • Pro Protein wird ein Nukleotid erkannt
13. Genome editing Eukaryoten
14. CRISPR/Cas9 in Eukaryoten • Kann die CRISPR/Cas9- Methode aus den Prokaryoten in Eukaryoten verwendet werden? • Zeitschrift ‚Science‘ erklärte die CRISPR/Cas9-Methode zum ‚Breakthrough of the year 2015‘
15. CRISPR/Cas in Eukaryoten • Was macht CRISPR/Cas9 so besonders? • Im Gegensatz zu Zinkfinger und TALENS, ist CRISPR/Cas9 einfacher anzuwenden, bedarf weniger Komponenten, kostengünstig • Um CRISPR/Cas9 in Eukaryoten anwenden zu können, wurde das System modifiziert
16. CRISPR/Cas9 in Eukaryoten • Wie funktioniert das CRISPR/Cas9- System in Eukaryoten?
17. CRISPR/Cas9 in Eukaryoten NHEJ • Non-homologous end joining • Nach dem Doppelstrangbruch werden die DNA-Fragmente wieder zusammengefügt, ohne dafür eine homologe DNA- Sequenz als Vorlage zu verwenden • Bei diesem Reparaturmechanismus können Deletionen, Insertionen= Mutationen auftreten HDR • Homology directed repair • Doppelstrangbrüche werden über homologe DNA-Sequenzen repariert, indem die offene Stelle mit einer ähnlichen Basensequenz eines zweiten DNA-Moleküls ausgetauscht wird, welches als Vorlage gilt
18. CRISPR/Cas9 in Eukaryoten
19. CRISPR/Cas9 in Eukaryoten
20. CRISPR/Cas9 in Eukaryoten- Pflanzenzelle • Wie wird das CRISPR/Cas9- System in Pflanzenzellen angewendet? • A) Protoplasten Transformation • B) Agroinfiltration
21. CRISPR/Cas in Eukaryoten- Pflanzenzelle Protoplasten Transformation • Pflanzenzellen werden über Enzyme vereinzelt • Die Zellwände werden über Enzyme aufgelöst, sodass Protoplasten über bleiben • Polyethylenglykol wird hinzugefügt, um die Membran porös zu machen, damit DNA- Sequenzen eindringen können Agroinfiltration • Agrobakterium tumefaciens trägt Plasmide, die als Vektor dienen, um DNA-Sequenzen in die Pflanze einzuschleusen • Pflanze wird mit Agrobakterium über Spritze in die Blätter infiziert • Plasmid-DNA dringt in Pflanzenzelle ein • Erwünschte Gene werden transkribiert und translatiert
22. Danke für Eure Aufmerksamkeit
23. Quellen • J. A. Doudna and E. Charpentier (2014):“The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9“, Science, Vol. 346, Issue 6213 • K. Belhaj et al. (2013):“Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas System“, Biomed Central, 9:39 • https://de.wikipedia.org/wiki/Zinkfingernukleasen • https://www.pflanzenforschung.de/de/themen/lexikon/homologe-rekombination-1756 • http://flexikon.doccheck.com/de/CRISPR-System#CRISPR-Locus • https://www.youtube.com/watch?v=SuAxDVBt7kQ • https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DerivateServlet/Derivate- 32233/Dissertation_Veronica_Hermanns.pdf • https://www.pflanzenforschung.de/de/themen/lexikon/crrna-10146 • https://www.youtube.com/watch?v=ouXrsr7U8WI • https://www.youtube.com/watch?v=7uQkQG3RfpE