日本薬局方－一般試験法 4.05 微生物限度試験法

微生物限度試験法は、非無菌製剤に適用する、医薬品に含まれる微生物の量の限度試験のことです。生菌数試験と特定微生物試験の2つがあります。

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1. 日本薬局方－一般試験法 4.05 微生物限度試験法 2020/6/25 Ver. 1.0
2. 微生物限度試験法 医薬品に含まれる微生物の量の限度試験のこと • 非無菌製剤＊に適用する • 生菌数試験と特定微生物試験がある • 生菌数は菌の種類を問わず、増殖可能な菌の数を測る • 特定微生物試験では、菌の種類を特定して存在を調べる ＊無菌製剤には<4.06>無菌試験法を適用する
3. 生菌数試験 中温性の好気的細菌・真菌を定量的に測定する • 有効成分が菌のものには適用しない • この試験と同等性が保たれていれば、自動化してもよい • 菌の生育を妨げるものはできる限り除く
4. 生菌数測定法 方法が3つある • メンブランフィルター法 • かんてん平板法 • 最確数（MPN）法 • 通常は上2つを用いる • MPN法は汚染菌数が非常に少ないときに有効
5. 試験菌の調製 試験の適格性確認のため、試験菌を利用する • Staphylococcus aureus • Pseudomonas aeruginosa • Bacillus subtilis • Candida albicans • Aspergillus brasiliensis 黄色ブドウ球菌（嫌気性グラム陽性細菌） 緑膿菌（好気性グラム陰性桿菌） 枯草菌（好気性グラム陽性） カンジダ菌（酵母類の菌） コウジカビ属の菌（真菌） • 日局に規定の培地で継代培養する • 試験はそれぞれの菌に対して行う
6. 試料の調製 試料の種類により、調整法が異なる • 水溶性試料 • 不溶性非脂質試料 • 脂質試料 • エアゾール • 経皮吸収パッチ 緩衝液か培地に溶解・希釈する 緩衝液か培地に界面活性剤を加え、溶解・希釈する 脂質に溶かすか、加温した界面活性剤を用いて溶解する 全量・一定量を無菌的に試料採取する 粘着面を保護し、界面活性剤を含む液で30分振とう溶解する
7. 試験法: メンブランフィルター法 試液を通したフィルターについた菌の数を調べる • 孔径0.45μmのフィルターを2枚用いる • フィルターを洗い、洗浄液を培地に広げる • 培養し、コロニー数を数える
8. 試験法: かんてん平板法 ペトリ皿上の寒天培地に菌を乗せ、菌を数える • 混釈法と表面塗布法がある • 混釈法では試料と培地を混ぜてペトリ皿に広げる • 表面塗布法では試料を培地表面に塗り広げる • 2枚培養し、コロニー数を数える
9. 試験法: 最確数（MPN）法 試料の希釈系を液体培養後に増殖の有無を確認する方法 • 試料の3段階10倍希釈系を作成する • 液体培地で3日を超えない期間培養する • 菌の増殖が認められた試験管の希釈率と数を求める • 最確数の表（日局記載）にしたがい最確数を求める
10. 培養の培地 総好気性微生物数と総真菌数測定で異なる培地を用いる 総好気性微生物数測定 ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト 寒天培地*1 総真菌数測定 サブロー・ブドウ糖寒天培地*2 (TAMC) (TYMC) TAMC: Total aerobic microbial count TYMC: Total combined yeast/moulds count *1 ダイズ蛋白とカゼインを分解したペプトン、塩を含む中性培地 *2 カゼイン分解ペプトンとブドウ糖を含む酸性培地
11. 結果の判定 CFU（Colony forming units）で規格が決められている • CFUは寒天上に形成されるコロニーの数 • 試料の量当たりのCFUで規定される
12. 特定微生物試験 医薬品に特定の種類の微生物が含まれないことを確認する試験 試験対象となる菌ごとに方法・判定法が規定されている • 胆汁酸抵抗性グラム陰性菌 • 大腸菌 • サルモネラ菌 • 緑膿菌 • 黄色ブドウ球菌 • クロストリジア • カンジダ・アルビカンス