日本薬局方－一般試験法 4.01 エンドトキシン試験法

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1. 日本薬局方－一般試験法 4.01 エンドトキシン試験法 2020/6/22 Ver. 1.0

2. エンドトキシンとは グラム陰性菌＊の外膜に存在するリポ多糖類のこと • 病原性細菌のほとんどはグラム陰性菌 • ショック症状、発熱などを引き起こす • 医薬品に含まれないことを確認する必要がある ＊ヨウ素液と赤色色素での染色（グラム染色）で染まりにくい。染まりやすいのはグラム陽性菌

3. エンドトキシン試験法 医薬品に含まれるエンドトキシンを定量する方法 • カブトガニの血球抽出成分（ライセート試薬）を用いる • ライセート試薬はエンドトキシンによりゲル化する

4. 器具の準備 基本的に乾熱滅菌する • ガラス・耐熱器具は250ºC、30分滅菌する • エンドトキシンフリーのプラスチック器具を用いる

5. 試料と標準溶液の作り方 エンドトキシンの混入を避ける • エンドトキシン標準品をエンドトキシン試験用水で溶解して、 希釈したものを標準溶液とする • 試料をエンドトキシン試験用水で溶解して、希釈したものを 標準溶液とする。pHを6－8に調整する

6. 最大有効希釈倍率 許容できる試料の最大の希釈率 • 試料に含まれる反応干渉物質を希釈により薄くする 最大有効希釈倍率 = (K / M ×

   試料濃度) / λ K: 発熱を起こす体重1kg当たりのエンドトキシン量、M: 1回あたりの注射剤の投与量 λ: ライセート試薬の表示感度、もしくは検量線の最小エンドトキシン濃度

7. 測定方法 大きく分けて2種類ある • ゲル化法 ゲルが流動性を失っていることを確認する方法 • 光学的定量法 ゲル化を光学的に捉える方法。濁度を測定する方法（比濁 法）と、発色基の遊離を調べる方法（比色法）がある 後者がより定量的

8. ゲル化法 ライセート試薬のゲル化を指標とする方法 精度と有効性の保証のため • 表示感度確認試験 • 反応干渉因子試験 を試験前に行う

9. ライセート試薬の表示感度確認試験 ライセート試薬の凝固に必要な最小エンドトキシン量を調べる • 最大有効希釈倍率のλのこと • エンドトキシン標準溶液の希釈系を4つ作る • ライセート試薬と希釈系を等量混和する • 37±1ºCで60

   ±2分静置し、180º回転させる • ゲルが流出しないとき、陽性とする ＊赤太字はすべての試験で共通

10. ライセート試薬の表示感度確認試験 • 0.25 λのエンドトキシン量で流出する • 幾何平均エンドポイント濃度＊が0.5~2 λの間になる ことを確認する ＊4回試験したときのエンドポイント濃度の対数の和を4で割り、対数の逆関数で処理したもの 0.25

    λ、0.5 λ、1 λ、2 λの液を用いて

11. 反応干渉因子試験 ゲル化を促進/阻害する因子の有無を調べる 液 エンドトキシン濃度／被添加液 希釈液 希釈倍数 エンドトキシン濃度 試験の回数 A 0／試料溶液

    - - - 4 B 2λ／試料溶液 試料溶液 1 2 4 8 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 4 C 2λ／エンドトキシン試験用水 エンドトキシン試験用水 1 2 4 8 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 2 D 0／エンドトキシン試験用水 エンドトキシン試験用水 - - 2 A-D液で試験を行い、 • AとDが陰性で、Cで表示感度を確認する • Bのエンドポイント濃度が0.5~2 λの間になる ことを確認する

12. 限度試験法と定量試験法 測定を限度試験とする場合と、定量する場合がある • 限度試験法では、陽性と陰性のコントロールを作成する • 定量試験法では、下の表の液でテストを行う 液 エンドトキシン濃度／被添加液 希釈液 希釈倍数

    エンドトキシン濃度 試験の回数 A 0／試料溶液 エンドトキシン試験用水 1 2 4 8 - - - - 4 B 2λ／試料溶液 - 1 2λ 4 C 2λ／エンドトキシン試験用水 エンドトキシン試験用水 1 2 4 8 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 2 D 0／エンドトキシン試験用水 エンドトキシン試験用水 - - 2

13. 光学的定量法: 比濁法 濁度変化を吸光度・透過率で測定し、定量化する • エンドポイント法とカイネティック法がある • エンドポイント法は反応後の濁度で定量する • カイネティック法は濁度の経時変化で定量する

14. 光学的定量法: 比色法 発色合成基質から遊離される発色基の量を定量する • エンドポイント法とカイネティック法がある • 発光基の量は吸光度・透過率で求める

15. 光学的定量法の予備試験 予備試験として • 検量線の信頼性確認試験 • 反応干渉因子試験 を行う • 検量線の相関係数の絶対値が0.98以上であることを確認する •

    反応干渉因子試験はゲル化法と同様